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So-Yun Lee(이소연),Munkhzaya Byambaragchaa(뱜바락차 뭉흐자야),Jeong-Soo Kim(김정수),Hun-Ki Seong(성훈기),Myung-Hwa Kang(강명화),Kwan-Sik Min(민관식) 한국생명과학회 2017 생명과학회지 Vol.27 No.8
eCG는 다른 포유동물에서 FSH와 LH의 활성을 나타내기 때문에 성선자극 호르몬 family에서 아주 특이적이고 많은 당쇄가 수식되어진 알파와 베타의 비공유결합으로 구성되어 있다. 유전자 재조합 eCGβ/α의 생물학적 기능을 규명하기 위하여 말의 LH/CGR의 포유동물발현용 벡터를 구축하였다. 재조합 eCGβ/α의 활성분석은 말의 LH/CGR가 일시적으로 발현되는 CHO-K1 세포와 지속적으로 발현되는 PathHunter Parental 세포를 이용하여 분석하였다. 유전자 재조합 eCGβ/α는 CHO-K1 부유세포의 상층으로 효율적으로 분비되었으며, 분비량은 transfection 후 1일에서 7일까지 약 200 mIU/ml이었다. Western blot 분석결과는 재조합 eCGβ/α의 분자량은 약 40-45 kDa으로 검출되었다. eLH/CGR가 발현되는 CHO-K1 세포에서의 cAMP분비량으로 재조합 eCGβ/α의 활성을 분석하였다. 그 결과 cAMP농도는 재조합 eCGβ/α의 농도의존적으로 증가하였다. eLH/CGR가 일시적으로 발현하는 CHO-K1 세포에서 EC50 값은 8.1±6.5 ng이었다. 또한 일시적 및 지속적으로 eLH/CGR가 발현하는 PathHunter Parental 세포에서도 재조합 eCGβ/α의 LH 활성 분석결과 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 이들의 EC50 값은 각각 5.0±4.7 ng/ml, 4.5±5.2 ng/ml으로 나타났다. 따라서 이러한 결과에 의하면 재조합 eCGβ/α는 말의 LH/CGR가 발현하는 세포에서 생물학적 활성을 나타난다는 것을 확인하였으며, PathHunter Parental 세포에서 지속적으로 발현되는 세포의 확보는 당쇄제거에 의한 재조합 eCG의 돌연변이등에 관한 기능적인 메커니즘을 밝히는데 유용할 것으로 사료된다. Equine chorionic gonadotropin (eCG) consists of highly glycosylated α- and β-subunits and is a unique member of the gonadotropin family, because it elicits the response characteristics of follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) in species other than the horse. To directly assess the biological function of rec-eCGβ/α, we constructed mammalian expressing vectors of equine luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptors (eLH/CGR). The activity of rec-eCGβ/α in vitro assayed in transient transfected CHO-K1 cells and in stably transfected PathHunter Parental cells with eLH/CGR was investigated. rec-eCGβ/α was efficiently secreted in the CHO-K1 suspension cell media, and the quantity detected was about 200 mIU/ml from 1 to 7 days after transfection. In the western blot analysis, the rec-eCGβ/α protein was broadly identified to be about 40~45 kDa molecular weight. The cAMP stimulation in CHO-K1 cells expressing eLH/CGR was determined to evaluate the activity of rec-eCGβ/α. The cAMP concentration increased in direct proportion to the concentration of the rec-eCGβ/α. The EC50 value in the transient transfected CHO-K1 cells was 8.1±6.5 ng. The stable cell lines of eLH/CGR were established in the PathHunter Parental cells expressing β-arrestin. We found that rec-eCGβ/α had full LH activity in the PathHunter Parental cells expressing eLH/CGR. The EC50 value in transient and stable cells was 5.0±4.7 ng/ml and 4.5±5.2 ng/ml, respectively. These results suggest that rec-eCGβ/α has a biological activity in a cell expressing eLH/CGR. These stable cells expressed in PathHunter Parental cells could be useful for elucidating the functional mechanisms of deglycosylated rec-eCGβ/α mutants.
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