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Prote in Kinase C Inhibitor (PKCI)에 의한 방사선 민감도 변화와 c - fos Proto-oncogene의 전사 조절
최은경(Eun Kyung Choi),장혜숙(Hyesook Cha ng),이연희(Yun-Hee Rhee),박건구(Kun-Koo Park) 대한방사선종양학회 1999 Radiation Oncology Journal Vol.17 No.4
목 적 : Ataxia-Telangiectasia (AT) 증은 여러 가지 유전적 결함을 갖는 질병으로 방사선 민감도가 비정상적으로 상승되어 있는 것이 특징이다. AT 환자에서 공통적으로 존재하는 ATM 유전자는 현재까지 방사선 신호전달에 관여하는 것으로 알려진 PI-3 kinase와 유사한 구조임이 알려져 ATM이 방사선 신호전달경로에 중요한 작용을 할 것으로 추정하게 되었다. 본 연구에서는 AT 세포와 정상세포에 PKCI를 과발현 시킴으로써 방사선 신호전달에 관여하는 PKC를 억제하여 이것이 방사선 민감도에 미치는 영향을 관찰하고, 방사선에 의해 유도되는 early response gene인 c- fos transcription의 차이를 측정하여 ATM과 PKCI에 의한 신호전달이 c- fos 유전자 전사에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. 대상 및 방법 : PKCI expression vector를 작제한 후 정상세포인 LM217과 AT세포인 AT5BIVA에 transfection 시킨 후 plasmid의 genomic DNA에 결합된 것은 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 확인하였고 PKCI의 mRNA 발현 여부는 northern blotting으로 확인하였다. 방사선 민감도는 아포토시스로 측정하였으며 PKCI가 과발현된 각 세포주에 5 Gy의 방사선을 조사한 후 48시간에 세포를 모아 TUNEL 방법으로 아포토시스 세포의 수를 측정하였다. c- fos 유전자의 전사는 reporter 유전자로 c- fos CAT plsmid를 β- gal expression vector와 같이 각 세포주에 transfection 시키고 36시간이 지난 후 CAT assay를 하여 activity를 측정하고 동시에 β- gal assay를 시행하여 transfection 효율을 보정해 주었다. PKCI, Ras의 영향을 보기 위하여는 PKCI, Ras expression vector와 c- fos CAT plasmid를 cotransfection하고 CAT activity로 측정하였다. 결 과 : 이 실험의 결과 LM과 AT 세포에서 PKCI가 방사선 민감도에 미치는 영향과 c- fos 전사에 미치는 영향을 처음으로 보여주었다. PKCI의 과발현이 LM 세포에서는 방사선 민감도를 증가시켰지만 AT 세포에서는 오히려 약간 감소시키는 작용을 나타내었다. c- fos 전사는 AT 세포에서 LM 세포에 비하여 70배 낮게 나타났는데 PKCI가 과발현 됨으로써 LM 에서는 c- fos의 전사가 감소되었지만 AT 세포에서는 영향이 없었다. Ras 단백으로 c- fos를 유도시키고 여기에 PKCI 발현 백터를 contransfection 하면 LM 세포에서는 induction 이 감소되었지만 AT 세포에서는 영향이 없었다. 즉 LM과 AT 세포에서의 PKCI에 의한 반응의 차이는 Ras와 관련된 signal transduction pathway라는 것을 알 수 있었다. 결 론 : PKCI는 정상세포에서는 방사선에 의한 세포 손상을 증가시키지만 AT 세포에서는 별 영향을 보이지 않는 것을 알 수 있었으며, 두 세포간의 이러한 차이는 c- fos proto- oncogene의 전사차이로 설명할 수 있겠다. 이러한 차이가 AT 세포의 방사선 민감도의 한 원인일 것으로 생각된다. Purpose :The human genetic disorder ataxia- telangiectasia (AT) is a multisystem disease characterized by extreme radiosensitivity. The recent identification of the gene mutated in AT, ATM, and the demonstration that it encodes a homologous domain of phosphatidylinositol 3- kinase (PI3- K), the catalytic subunit of an enzyme involved in transmitting signals from the cell surface to the nucleus, provide support for a role of this gene in signal transduction. Although ionizing radiation was known to induce c- fos transcription, nothing is known about how ATM or PKCI mediated signal transduction pathway modulates the c- fos gene transcription and gene expression. Here we have studied the effect of PKCI on radiation sensitivity and c- fos transcription in normal and AT cells. Materials and Methods : Normal (LM217) and AT (AT5BIVA) cells were transfected with PKCI expression plasmid and the overexpression and integration of PKCI was evaluated by northern blotting and polymerase chain reaction, respectively. 5 Gy of radiation was exposed to LM and AT cells transfected with PKCI expression plasmid and cells were harvested 48 hours after radiation and investigated apoptosis with TUNEL method. The c- fos transcription activity was studied by performing CAT assay of reporter gene after transfection of c- fos CAT plasmid into AT and LM cells. Results :Our results demonstrate for the first time a role of PKCI on the radiation sensitivity and c- fos expression in LM and AT cells. PKCI increased radiation induced apoptosis in LM cells but reduced apoptosis in AT cells. The basal c- fos transcription activity is 70 times lower in AT cells than that in LM cells. The c- fos transcription activity was repressed by overexpression of PKCI in LM cells but not in AT cells. After induction of c- fos by Ras protein, overexpression of PKCI repressed c- fos transcription in LM cells but not in AT cells Conclusion :Overexpression of PKCI increased radiation sensitivity and repressed c- fos transcription in LM cells but not in AT cells. The results may be a reason of increased radiation sensitivity of AT cells. PKCI may be involved in an ionizing radiation induced signal transduction pathway responsible for radiation sensitivity and c- fos transcription. The data also provided evidence for novel transcriptional difference between LM and AT cells.
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