유전질환 진단에 있어서의 Fluorescence in Situ Hybridization ( FISH ) 법의 임상적 유용성

양영호(Young Ho Yang),강지용(Ji Yong Kang),양은석(Eun Suk Yang),장시영(Si Young Jang),조재성(Jae Sung Cho),박용원(Yong Won Park),김인규(In Kyu Kim),김세광(Sei Kwang Kim),남명숙(Myung Sook Nam) 대한산부인과학회 2002 Obstetrics & Gynecology Science Vol.45 No.6

서론 : 전통적인 유전학적 검사는 상대적으로 많은 배양시간과 노력 및 전문적인 인력을 필요로 한다. 그러나 임상에서는 치료에 대한 빠른 결정을 위해서는 보다 빠르고 정확한 진단방법이 필요하다. 형광결합보체법은 그 신속성과 정확성 때문에 염색체의 이수성을 진단하기 위한 많은 연구가 이루어져 왔다. 목적 : 유전질환의 임상 진단에 있어서 형광결합보체법의 유용성을 알아보고자 한다. 연구 대상 및 방법 : 유전질환이 의심되는 63명의 환자로 부터 말초혈액 및 성선조직을 채취하였으며, 산전 유전 상담을 위하여 내원한 임신 9주에서 30주 사이의 15명의 산모를 대상으로 융모막 (n=6), 양수 (n=7) 및 제대혈 (n=2)을 채취하여 전통적인 핵형검사 및 DNA specific probe를 이용한 형광결합보체법을 시행하였으며 두 검사방법에 따른 결과를 서로 비교하였다. 결과 : 17예의 산전유전학적 검사에서는 trisomy 21, trisomy 18, monosomy 1, 47XYY 그리고 47XXY가 각각 1예로 FISH법에 의하여 핵형검사와 일치하는 결과를 보였으며, 8예의 비정상 성분화 환아에서는 모자이시즘이 의심되는 1예를 제외한 7예에서 두 검사법이 일치하는 결과를 보였다. 9예의 Turner 증후군 환아에서는 9예 모두에서 두 검사법의 결과가 일치하였으며, Prader-Willi syndrome이 의심되는 총 29명의 대상 환아 중 14명은 FISH법으로만 진단되었고, 4명은 FISH법과 고해상 G-banding법으로 모두 진단되었으며, 10명 (34%)은 두 방법 모두 진단이 되지 않았다. Angelman syndrome이 의심되는 11명의 환아 중 2명은 두 방법 모두에서 진단되었으며, 4명은 FISH법만으로 진단되었고, 5명 (45%)의 환아에서는 두 방법 중 어떠한 방법으로도 진단되지 못하였다. Williams syndrome이 의심되는 4명의 환아 중 1명 (25%)은 두 방법 모두에서 진단되었으며, 2명(50%)은 FISH법으로만 진단되었고, 나머지 1명 (25%)의 환아에서는 두 방법 중 어떠한 방법으로도 진단되지 못하였다. 임상적으로 Digeorge syndrome 및 Miller-Dieker syndrome이 의심되는 두 환아에서는 FISH 및 핵형분석 결과가 모두 정상소견을 보였다. 결론 : FISH법은 유전질환 진단에 있어서 전통적인 염색체 핵형분석법과 더불어 그 임상 진단적인 면에서 신속 정확하고 탁월한 방법으로 사료되며, 향후 종양유전학 및 유전적 내분비 질환 분야 등에서 매우 유용하게 응용되리라 기대된다. Introduction : The traditional cytogenetic analysis requires relatively long cell culture time, intensive labour and trained personnel. But, in clinical situations, rapid diagnosis of genetic disease is very important for urgent decision for future management. So we need more rapid and precise diagnostic tools for clinical genetic counselling. The fluorescence in situ hybridization (FISH) has been studied for detecting chromosomal aneuploidies because this method can get rapid and precise results of cytogenetic studies. Objective : To evaluate the clinical utility of fluorescence in situ hybridization technique as a diagnostic tool of chromosomal anomaly. Methods : Peripheral blood or gonadal tissue were obtained from the patients (n=63) clinically suspicious of genetic disease. Chorionic villi (n=6), amniotic fluid (n=9), and fetal cord blood (n=2) were obtained from 15 pregnancies undergoing fetal karyotyping at 9 to 30 weeks of gestation for prenatal genetic counselling. Karyotyping was performed by both traditional cytogenetics and FISH, using commercially available kits. After the procedures, the results of FISH were compared with the results of traditional cytogenetic studies. Results : In a blind series of 17 samples all, including trisomy 21 (1 case), trisomy 18 (1 case), monosomyX (1 case), 47,XYY (1 case), and 47,XXY (1 case), were correctly identified. FISH results were correspondent with conventional karyotyping results in 7 patients with intersex except one case of suspicious of mosaicism. In nine children of Turner syndrome, the results of two methods were correspondent too. There was a fluorescent signal defect in band 15 q11-q13 in one of chromosome 15 in 18 children of 29 patients, clinically suspicious of Prader-Willi syndrome, with FISH method and only four patients were diagnosed as Prader-Willi syndrome with G-banding microscope. It was impossible to identify the defect in chromosome 15 q11-q13 in 10 (34%) children by both methods. Two children of 11 patients, clinically suspicious of Angelman syndrome, were diagnosed as Angelman syndrome with both method respectively. And four children were diagnosed as Angelman syndrome only with FISH method. In 5 cases, we cannot detect the defect in chromosome 15 q11-q13 with both methods. In four cases of Williams syndrome, the results of both methods were as follows; 1 case (25%): diagnosed as Williams syndrome by both methods; 2 cases (50%): diagnosed as Williams syndrome by only FISH method; 1 cases (25%): negative in both methods. We could not detect microdeletion in the cases clinically suspicious of Digeorge syndrome and Miller-Dieker syndrome. Conclusion : FISH is a rapid and effective diagnostic method, which can be used as an adjunctive test to traditional cytogenetic analysis, for detection of chromosomal aneuploidies in clinical diagnosis for genetic disease.

임산부 말초 혈액에 존재하는 태아 세포 분리 및 이를 이용한 산전 다운증후군의 유전자 분석

김성훈(Sung Hoon Kim),양영호(Young Ho Yang),조동제(Dong Jae Cho),김세광(Sae Kwang Kim),박용원(Yong Won Park),김인규(In Kyu Kim),이윤호(Yoon Ho Lee),김미순(Mi Sun Kim),남명숙(Myung Sook Nam) 대한산부인과학회 2001 Obstetrics & Gynecology Science Vol.44 No.2

배경 및 목적 : 다운증후군 (Down's syndrome)은 700-1000명당 1명꼴로 발생하는 출생아에서 가장 흔한 선천성염색체 이상 질환이다. 현재까지 이의 산전 유전 진단을 위해 사용되어 온 양수천자, 융모막 채취, 태아 제대 혈액 채취등은 침습적인 방법으로 태아 및 산모에게 드물지만 치명적인 위험이 있으며, Triple marker등의 비침습적인 방법은 그 정확도가 60%에 그쳐 보다 정확한 방법이 요구되었다. 본 연구에서는 모체 혈액내에 미량으로 존재하는 태아 유핵적혈구(nRBC)의 분리와 이를 이용한 chromosome 21의 유전자 분석을 통하여 다운증후군의 새로운 비침습적 산전 진단법을 확립하고자 한다. 재료 및 방법 : 본원에 내원한 총 76명의 산모를 대상으로 20ml의 말초 혈액을 뽑아 heparin 처리한 후, 태아 세포의 분리를 위해 triple density gradient법과, CD45, CD71을 이용한 Vario-MACS와 Mini-MACS를 시행한 후, Kleihaur-Betke stain으로 태아 유핵적혈구의 형태학적인 구분하였다. 또한, GPA-immunostain을 실시하여 태아 유핵 적혈구를 확인하고, 그 위치를 marking한 후 FISH를 시행하였다. 결과 : 총 76명의 임신 8주에서 41주 사이의 산모에서 유핵적혈구는 모든 예에서 발견되었으며, K-B stain을 실시하여 형태학적인 구분을 하였다. 20ml의 말초 혈액 중에 평균 15개의 유핵적혈구가 발견되었으며, 임신 12-18주 사이에 가장 많은 수의 유핵적혈구가 관찰되었고(18.9±6.0개), 임신 20주이후에는 주수에 따라 감소하는 양상을 나타내었다. 또한, GPA-immunostain을 시행한 후, probe X, Y를 이용하여 시행한 FISH를 통하여 태아의 성별을 진단하였고, 고령의 임산부와 Triple marker에서 양성 소견을 보인 30예에서 probe 21을 이용하여 FISH를 시행하여 3예의 다운증후군을 진단하였다. 이 결과들은 동시에 실시된 양수천자나 융모막 채취의 결과와 일치함을 확인하였다. 결론 : 태아 유핵적혈구는 임신 8주 이상의 모든 산모에서 분리 가능하였다. 분리된 태아 유핵적혈구를 이용한 GPA-immuno FISH 분석을 통한 다운증후군(trisomy 21)의 산전 유전 진단법은 유용하고, 혁신적이며, 정확하고, 빠른 비침습적 방법이나, 임상적으로 사용되기 위해서는 추후 더 많은 예의 연구가 필요할 것으로 사료되어진다. Introduction : Down's syndrome is the most common congenital chromosomal anomalies which occurs 1 out of 700-1000 births. Until now, for prenatal diagnosis of Trisomy 21, invasive techniques such as amniocentesis, chorionic villus sampling(CVS) and cordocentesis were used, but they encompass the rare possibility of morbidity to the mother and fetus. Triple marker using maternal serum is a currently used noninvasive method, but it only shows the accuracy of 60%. Accordingly, a noninvasive method, using fetal cells from maternal blood is under extensive investigation. This study was undertaken to establish a noninvasive prenatal genetic diagnostic method of trisomy 21 using fetal nRBCs rarely present in maternal circulation. Materials and Methods : Peripheral venous blood samples were collected from 76 women and treated by heparin. For the isolation of fetal cells, we used a triple density gradient centrifugation, and Vario-MACS and Mini-MACS using CD45 and CD71, and then, the morphological differentiation of the fetal nRBC was performed by Kleihaur-Betke stain. With GPA immunostain, nRBCs were identified by cytoplasm and GPA attatchment, and after marking the site, a FISH was performed. Results : This study population included 76 patients from 8 to 41 weeks of gestation, and nRBC was separated from all cases. The morphological differentiation was achieved by K-B stain. The mean number of nRBC collected from 20 ml of maternal peripheral blood was 15. The number of nRBCs retrieved reached its peak in 12-18 gestational weeks(18.9 6.0) which decreased from 20 gestational weeks and thereafter. Fetal sex was determined by FISH analysis using probe X, Y with GPA-immunostained cells. GPA-immuno FISH analysis using probe 21 in 30 cases of advanced maternal age or positive triple markers, we confirmed 3 cases of Down's syndrome. These results were also confirmed using the CVS or amniocentesis. Conclusions : Fetal nRBCs were separated from all cases after 8 gestational weeks. Prenatal diagnosis of trisomy 21 through GPA-immuno FISH analysis of chromosome 21 using separated fetal nRBCs is an useful, innovative, accurate, rapid and non-invasive diagnostic method. But for clinical use, more cases of experiments will be needed.