Rapid Detection of Cochlodinium polykrikoides by Sandwich Hybridization Integrated with Invertase Assay

Mingyeong Kang(강민경),Mirye Park(박미례),Taek-Kyun Lee(이택견) 한국산학기술학회 2019 한국산학기술학회논문지 Vol.20 No.8

유해조류 대발생(harmful algal blooms, HABs)을 유발하는 해양 미세조류의 신속하고 정확한 종판별은 HABs을 예측하고 관리하기 위한 매우 중요한 도구이다. 우리는 이전 연구에서 적조 유발 미세조류인 Cochlodinium polykrikoides 를 현장에서 검출하기 위한 nuclease protection assay sandwich hybridization (NPA-SH) 방법을 개발한 바 있다. 본 연구에서는 C. polykrikoides 검출을 위한 NPA-SH 방법의 반응 단계를 간소화시켜 현장 적용성을 향상시키는 것을 목적으로, signal probe에 형광 대신 invertase (INV)를 결합시켰으며, hybridization 과정에서 sucrose를 반응물로 사용하여 발색 반응을 유도하였다. INV와 signal probe의 결합 여부는 SDS-PAGE와 형광 현미경을 사용하여 확인하였으며, 반응 최적화를 위한 적정 프로브의 양, sucrose의 양 및 처리시간 등을 정립하였다. 본 연구의 결과 개발된 INV-SH는 NPA-SH와 비교하여 현장에서의 처리시간이 감소되었으며, 흡광도 측정기 뿐만 아니라, 상대적으로 부피가 작고 값 싼 개인 혈당계 사용이 가능하게 되었다. 본 연구에서 개발된 INV-SH는 INV가 적용된 최초의 C. polykrikoides 종판별 기술이며, 증진된 현장기술이 될 수 있다. Rapid and accurate identification of marine microalgae causing harmful algal blooms (HABs) is a crucial tool for predicting and managing HABs. We previously developed a nuclease protection assay sandwich hybridization (NPA-SH) method for the in situ detection of blooming microalgae Cochlodinium polykrikoides . In this study, we improved the applicability of the NPA-SH method for the detection of C. polykrikoides by simplifying the reaction step. For this purpose, invertase (INV) was conjugated to the signal probe instead of using fluorescence, and sucrose was used as a reactant to induce a color reaction. The INV-signal probe conjugation was confirmed by SDS-PAGE and epifluoromicroscopy. The treatment time and appropriate amounts of the probe and sucrose that optimized the reaction were determined. As a result, the developed INV-SH reduced the treatment time in the field compared with NPA-SH, and also enabled the use of a relatively small volume and low-priced personal glucose meter, as well as an absorbance meter. INV-SH is the first C. polykrikoides species identification technology to which INV has been applied and could be an improved field technique.

Development of a Nuclease Protection Assay With Sandwich Hybridization (NPA-SH) to Monitor Heterosigma akashiwo

Mingyeong Kang(강민경),Mirye Park(박미례),Kang Eun Kim(김강은),Taek-Kyun Lee(이택견) 한국생명과학회 2020 생명과학회지 Vol.30 No.1

Heterosigma akashiwo는 전세계적으로 분포된 침편모조류이며, 대발생을 형성하여 많은 나라의 양식산업에 커다란 손실을 유발시킨다. 따라서 빠르고 민감한 검출방법을 개발하는 것은 유해조류 대발생에 대한 적절한 경보를 위해서 필요하다. 이 연구에서는 H. akashiwo를 정성 및 정량적으로 검출하기 위하여 뉴클레아제 보호 분석이 통합된 샌드위치 혼성(NPA-SH)을 개발하였다. NPA-SH 프로브는 여섯 종의 미세조류 핵산 서열을 이용하여 디자인 후, 특이성을 확인하여 capture 프로브와 signal 프로브를 선정하였다. 배양시료와 현장시료를 이용하여 NPA-SH의 적용성을 평가한 결과, NPA-SH의 좋은 적용성과 효과를 확인하였다. H.akashiwo의 정량분석을 위한 선형회귀식을 확인하였으며, 최소 검출한계는 1×10⁴ cells/ml이었다. NPA-SH를 사용하여 얻은 H. akashiwo의 정량결과와 현미경을 사용하여 얻은 결과 사이에는 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. NPA-SH 분석은 환경시료에 잘 적용되었다. 이러한 결과는 NPA-SH가 H. akashiwo의 모니터링에 사용되어 왔던 전통적인 현미경적 방법에 대한 좋은 대안이 될 수 있음을 보여준다. Heterosigma akashiwo is a globally distributed raphidophyte that forms blooms and causes significant losses to the aquaculture industry in many coastal countries. The development of a fast and sensitive detection method is therefore required to facilitate the appropriate warning of harmful algal blooms. In this study, a nuclease protection integrated with sandwich hybridization (NPA-SH) assay was developed to both qualitatively and quantitatively detect H. akashiwo. The NPA, capture and signal probes were designed by nucleotide sequencing of H. akashiwo. The applicability of NPA-SH was evaluated using cultured H. akashiwo cells and field samples collected at Goseong Bay, Korea. The results show that this method has good applicability and effectiveness in analyzing cultured cells and field samples. A linear regression equation for the quantitative analysis of H. akashiwo was obtained, and the lower detection limit of the assay was 1×10⁴ cells/ml. There was no statistically significant difference in the results of H. akashiwo quantitation using NPA-SH compared to those obtained using a microscope. These results indicate that NPA-SH can be a good alternative to the traditional microscopic method used to monitor H. akashiwo.

Application of a Peptide Nucleic Acid-Based Asymmetric Real-Time PCR Method for Rapid Detection of Vibrio cholerae

Mingyeong Kang(강민경),Taek-Kyun Lee(이택견) 한국산학기술학회 2019 한국산학기술학회논문지 Vol.20 No.12

비브리오 콜레라는 수산물과 선박평형수 내에서 모니터링되고 있는 중요 병원성 박테리아이다. 이를 검출하기 위한 여러 방법들이 개발되어 왔으나, 시간 소모가 크고 민감도에서 한계가 있었다. 본 연구는 비브리오 콜레라를 보다 정확하게 검출하기 위한 방법을 개발하는 목적으로 수행하였다. PNA 기반 비대칭 real-time PCR 기술에 적용하기 위하여 펩티드 핵산(Peptide nucleic acid, PNA) 프로브를 개발하였다. 독성 유전자인 Cholera enterotoxin subunit B (ctxB) 를 비브리오 콜레라 검출을 위한 타겟 유전자로 선정하고, conventional PCR과 real-time PCR을 위한 positive template를 합성하였다. Real-time PCR 프라이머와 PNA 프로브를 디자인하여, 정량 분석을 위한 표준곡선실험을 수행하였다. 선택된 PNA 프로브는 비브리오 콜레라에 특이적으로 반응하였으며, 검출한계는 0.1 cfu/100 mL이었다. 종합해 보면, 본 연구에서 개발된 PNA 프로브와 비대칭 real-time PCR 방법은 수산물과 선박평형수 뿐만 아니라 해양환경에 있는 비브리오 콜레라를 신속하고 정확하게 모니터링할 수 있는 기술로 판단된다. Vibrio cholerae is a very important pathogenic bacterium that has to be monitored in seafood and ships" ballast water. Various methods have been developed to identify this bacterium, yet these methods are time-consuming and have limitations for their sensitivity to detect contamination. The purpose of the present study was to develop a robust and reliable method for identifying V. cholerae. Peptide nucleic acid (PNA) probes were developed to use for PNA-based asymmetrical real-time PCR techniques. The toxigenic Cholera enterotoxin subunit B (ctxB) gene was selected as a target for detecting V. cholerae and the gene was synthesized as a positive template for conventional and real-time PCR. Real-time PCR primers and PNA probes were designed and standard curves were produced for the quantitative analysis. The selected PNA probes reacted specifically to V. cholerae without any ambiguity, even among closely related species, and the detection limit was 0.1 cfu/100 mL. Taken together, the PNA probes and asymmetrical qPCR methods developed in this present study could contribute to the rapid, accurate monitoring of V. cholerae in marine environments, and as well as in seafood and ships" ballast waters.

Marine Metatranscriptome Profiling in the Sea Adjacent to Jeju Island, Korea, by RNA-sequencing

Jinik Hwang(황진익),Mingyeong Kang(강민경),Kang Eun Kim(김강은),Seung Won Jung(정승원),Taek-Kyun Lee(이택견) 한국생명과학회 2020 생명과학회지 Vol.30 No.7

바다는 바이러스를 포함하는 다양한 생물체의 풍부한 자원을 제공한다. 본 연구에서는 계절에 따른 제주 바다의 해양 미생물 군집을 확인하기 위해 3월과 12월에 해수 샘플을 수집하여 total RNA를 추출, HiSeq2000 및 de novo 전사체 어셈블리를 사용한 NGS를 실시하였다. 그 결과, 3월 및 12월 시료에서 각각 652,984 및 163,759 개의 전사체를 확인하였다. 3월 샘플에서는 해양 박테리아가 우점하였으나 12월 샘플에서는 진핵생물이 우점하였다. 박테리아 군집은 두 샘플간에 상이하였으며, 이는 계절 변화 동안 박테리아 군집이 변화하였음을 보여주었다. 또한, 해양바이러스를 확인하기 위하여, Megablast를 사용하여 바이러스 참조 데이터베이스에 전사체를 검색하였다. 해양박테리아를 감염시키는 박테리오파지가 두 샘플에서 우점하는 것을 확인하였다. 그러나, 우리는 두 개의 전사체에서 다양한 헤르페스바이러스와 관련된 transcripts가 풍부함을 확인하였으며, 이는 제주도 인근 바다에서 물고기를 감염시키는 헤르페스바이러스의 위협 가능성을 나타낸다. 종합하면, 우리의 데이터는 해양 커뮤니티 연구 및 가능한 해양 바이러스 병원체를 식별하는 데 유용할 것이다. The Ocean is a rich source of diverse living organisms include viruses. In this study, we examined the microbial communities in the sea adjacent to Jeju Island in two seasons by metatranscriptomics. We collected and extracted total RNA, and, using the next-generation sequencing HiSeq 2000 and de novo transcriptome assembly, we identified 652,984 and 163,759 transcripts from the March and December samples, respectively. The most abundant organisms in March were bacteria, while eukaryotes were dominant in the December sample. The bacterial communities differed between the two samples, suggesting seasonal change. To identify the viruses, we searched the transcripts against a viral reference database using MegaBLAST with the most identified being bacteriophages infecting the marine bacteria. However, we also revealed an abundance of transcripts associated with diverse herpesviruses in the two transcriptomes, indicating the presence or possible threat of infection of fish in the sea around Jeju Island. This data is valuable for the study of marine microbial communities and for identifying possible viral pathogens.

Sensory evaluation of a body lotion formulated with hot spring water from Deokgu, Korea

So Jung Kim(김소정),Mingyeong Kang(강민경),Taek-Kyun Lee(이택견) 한국산학기술학회 2019 한국산학기술학회논문지 Vol.20 No.4

이 연구의 목적은 바디로션 제조 시 화장품 첨가제로서의 덕구온천수를 평가하기 위함이다. 주요 수용성 구성성분으로서의 온천수의 적합성을 시험하였다. 온천수의 미생물 및 화학적 안전성 시험이 수행되었다. 대장균을 비롯한 미생물은 검출되지 않았거나 검출한도 이하로 검출되었으며, 유해한 중금속은 전혀 검출되지 않았다. 온천수의 세포독성이 평가되었으며, 온천수의 pH 변화를 3달 동안 측정하였다. 또한 덕구온천수 및 증류수로 제조된 바디로션에 대해서 관능시험을 수행함으로써 소비자의 적합성을 관능특성 분석을 통하여 평가하였다. 증류수로 제조된 바디로션보다 온천수를 사용한 바디로션을 피부에 적용하였을 때, 피부보습, 피부트러블 및 피부 장벽강화가 증진되었다. 종합해 보았을 때, 이 연구의 결과는 화장품 제조에 있어서 온천수를 사용하는 것은 화장품의 효능을 증진시킬 수 있음을 보여 준다. The purpose of this study was to evaluate hot spring water (HSW) from Deokgu as a cosmetic ingredient in the preparation of a body lotion. The HSW was tested for its suitability as an aqueous-phase main component. Microbiological and chemical stability tests of the HSW were carried out. Microorganisms including E. coli were not detected or detected below the detection limits, and no harmful heavy metals were found. The cytotoxicity of the HSW was also considered, and its pH determined over a period of three months. Further, sensory characteristics were assessed for consumer acceptance by performing sensory tests on body lotions formulated using either Deokgu HSW or distilled water. Skin moisturization, irritation and tension reinforcement were found to be enhanced when using the HSW lotion rather than that formulated with distilled water. Taken together, the results of this study show that the use of HSW in cosmetic formulations contributes to the efficacy of these products.

Enhancement effects of sea mustard and starfish mixtures on skin activity

So Jung Kim(김소정),Mingyeong Kang(강민경),Kang Eun Kim(김강은),Taek-Kyun Lee(이택견) 한국산학기술학회 2019 한국산학기술학회논문지 Vol.20 No.12

해양생물 추출물의 화장품 첨가제로써의 활용 가능성을 파악하고자, 미역 추출물, 불가사리 콜라겐 펩티드 및 혼합물의 피부 활성증진 효과를 평가하였다. 추출물의 피부 활성 증진 평가를 위하여 항염 활성, 미백효과 및 피부탄성증진 활성을 분석하였다. 피부활성증진 평가를 위한 바이오마커로는 NO 생성 저해, 티로시나제 및 엘라스타제 저해 활성법을 적용하였다. 미역 추출물, 불가사리 콜라겐 펩티드 및 혼합물은 실험구간인 1.0-50 μg/mL까지 세포독성을 나타내지 않았다. 또한 미역 추출물, 불가사리 콜라겐 펩티드 및 혼합물은 농도의존적으로 NO 생성 저해, 티로시나제 및 엘라스타제 저해 활성이 증가하였다. 특히 혼합물를 사용하는 경우 미역 추출물 및 불가사리 콜라겐 펩티드를 단독으로 사용하는 것에 비하여 크게 활성이 증가하는 경향을 보였다. 종합해 보았을 때, 생물유래 천연추출물이 화장품 첨가제로 적용할 경우, 혼합물을 첨가하는 것이 단일 추출물로부터 얻을 수 있는 효과보다 더 좋은 시너지 효능이 있을 수 있다는 것을 알게 해준다. 따라서 본 연구의 결과는 천연추출물을 화장품 첨가로써 활용하는 경우 추출물의 종류 및 배합 연구에 공헌할 수 있을 것이다. The enhancement effects of sea mustard extract (SME), starfish collagen peptide (SCP) and a mixture of the two (MIX) on skin activity were evaluated to investigate the possibility of using marine-derived extracts as cosmetic additives. The anti-inflammatory activity, whitening activity and skin elasticity activity of the extracts were analyzed to evaluate their skin-activating effects. Inhibiting the generation of nitric oxide (NO) and the tyrosinase and elastase inhibitory activities were assessed as the bio-markers for evaluating skin activity. SME, SCP and MIX did not show cytotoxicity within the concentration range of 1.0-50 μg/mL. In addition, SME, SCP and MIX all increased NO production and the tyrosinase and elastase inhibitory activities in a concentration-dependent manner. The activity of MIX was significantly increased compared to that with using SME or SCP alone. Taken together, when natural extracts are applied as cosmetic additives, the results demonstrate that using a mixture of SME and SCP may have a greater synergistic effect than that when using only a single extract. Therefore, this study contributes to the knowledge about the kinds and composition of several natural extracts when they are used as cosmetic additives.

녹조의 생물학적 제어

안치용 ( Chi-yong Ahn ),오희목 ( Hee-mock Oh ),고소라 ( So-ra Ko ),르반베 ( Ve Van Le ),강민경 ( Mingyeong Kang ) 한국물환경학회 2023 공동춘계 학술발표회 논문집 Vol.2023 No.0