(The)signaling pathway of autotaxin/Iysophopholiase D in human melanoma cell migration

정인덕 Konyang Univ. 2006 국내박사

Anti-inflammatory and immunosuppressive effect of equol, a soy bean-derived isoflavone

여아름 Konyang Univ. 2012 국내석사

Equol은 이소플라본의 한 종류로 daidzein으로부터 대사 작용에 의해 만들어진다. Equol은 prostate cancer, menopose 후의 physiological change, male pattern baldness 와 acne의 치료 등의 여러 가지 분야에서 연구되어지고 있다. 그러나, equol의 항염증 효과에 관한 연구 결과는 아직 보고되지 않은 실정이다. 본 연구에서는 α-CD3ε로 자극된 T 세포의 활성화와 Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 RAW 264.7 대식세포의 염증에 미치는 equol의 면역조절 및 항염증 효과를 조사하였다. LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포의 염증작용에서 equol을 전처리 하였을 경우, NO의 생성은 물론 IL-6와 TNF-α와 같은 pro-inflammatory cytokine의 생성이 억제되었다. 또한, equol은 또 다른 염증관련 인자인 PGE2 의 생성도 현저하게 억제하였다. 위의 결과들을 RT-PCR로 분석해보았을 때, LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 equol이 iNOS, IL-6, TNF-α의 mRNA의 발현을 감소시키고 α-CD3ε로 자극된 T 세포에서 IL-2, IL-4, IL-6 와IFN-γ의 mRNA의 발현을 감소키기는 것을 확인할 수 있었다. 또한 equol은 LPS에 의한 IκB의 인산화를 억제하여 NF-κB의 활성화에 의한 핵내전위 (translocation)를 저해하는 것으로 나타났다. RAW 264.7 대식세포는 LPS로 자극하기 전 equol을 처리했을 경우, ERK, JNK, p38 등의 MAP kinases의 인산화를 억제하였다. 더욱이 LPS 투여에 의해 패혈증을 유발시키는 동물 모델에서, equol의 투여에 의해 혈중 Cytokine의 분비는 물론 패혈증에 의한 치명적 증상 발현을 완전히 억제하는 것으로 밝혀졌다. T 세포의 활성화 실험에서는, 비장세포와 비장에서 분리한 T 세포를 α-CD3ε (5 μg/ml)로 24시간 자극하였다. 그리고 RAW 264.7 대식세포에서의 염증유도 실험에서는 세포 (1×104)를 3 μg/ml의 LPS로 24시간 동안 자극하였다. equol의 처리는 T 세포와 RAW 264.7 대식세포에 α-CD3ε 혹은 LPS를 처리하기 15시간 전에 시행하였다. α-CD3ε로 자극 된 T 세포의 활성에서 equol의 면역억제 효과는 Th1-type (IL-2, IFN-γ)과 Th2-type (IL-4, IL-6)의 cytokine생성분비 억제 효과를 통해 확인하였다. 이러한 결과들은 equol이 α-CD3ε로 자극한 T 세포에서 IL-2, IL-4, IL-6 와IFN-γ의 생성을 억제하고, LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포의 염증반응을 억제한다는 것을 시사한다. RAW 264.7 대식세포에서의 equol의 항염증 효과는 NF-κB활성과 MAP kinase의 인산화의 억제를 통한 NO의 발현과 pro-inflammatory cytokine의 억제에 있다고 생각된다. 따라서 equol은 endotoxin으로 유도된 대식세포의 염증을 억제하고 T 세포 활성을 억제하는 활성을 가진 면역 조절 물질인 것으로 사료된다.

Hsp25 expression during post-natal development of Korean wild mouse cerebellum

김철태 Konyang Univ. 2007 국내박사

본 연구는 일반 마우스(Balb/c, ICR, C57BL/6), 운동실조 마우스(Rolling Mouse Nagoya, Tottering, Leaner)와는 상이한 한국산 야생 마우스 소뇌의 Hsp25의 발현을 출생 후 발생단계에 따라 변화의 차이를 비교 확인하였다. Hsp25란 세포나 조직이 생체의 다양한 스트레스 자극에 노출될 경우 세포들은 일종의 자가보호 단백질인 Heat shock protein (Hsp)을 생산하여 빠르게 스트레스 자극에 반응한다. 이들 단백질은 최초로 열 자극에 의한 고온환경에 의해 유도되어 발견되었기에 “heat shock protein”이라 불리게 되었으나 여러 연구가 진행되면서 열자극에 의한 고온환경뿐만 아니라 열 자극과 무관한 다양한 자극들 즉 중금속, 산화제, 박테리아나 바이러스 감염 같은 병리적 자극, 염증, 허혈, 외상, 성장호르몬을 포함한 다양한 호르몬, 약물, 화학약품 등의 자극에 노출될 경우 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다. Pogo 마우스란 한국산 야생 마우스(KJR)에서 유래된 선천적으로 행동이상을 보이는 돌연변이 마우스로 유전학적 연구를 통하여 Pogo 마우스는 염색체 8번에 돌연변이를 가지며 전자현미경적으로 조롱박세포와 과립세포 사이에 비정상적 연결을 형성하고 있다. Part Ⅰ- 한국산 야생 마우스의 소뇌에서 Hsp25 발현 패턴 본 연구는 일반 마우스와 한국산 야생 마우스에서의 Hsp25의 발현 정도를 살펴보았다. 마우스 소뇌벌레는 앞쪽에서 뒤쪽으로 4개의 transverse zone으로 구분하며 앞쪽보다 anterior zone (AZ, lobules I-V), central zone (CZ, lobules VI-VII), posterior zone (PZ, lobule VIII) 그리고 nodular zone (NZ, lobules IX-X)으로 세분할 수 있다. 이미 성체 일반 마우스 소뇌에서 CZ과 NZ의 일부 조롱박세포에서 Hsp25가 발현됨이 보고되었다. Hsp25 면역반응은 조롱박세포의 신경 세포체와 분자층에 위치한 수상돌기에서 관찰되며 이들의 면역반응은 관상단면상에서 앞쪽에서 뒤쪽으로 연결되는 3개의 parasagittal band가 형성되는 것으로 이미 알려져 있다. 본 연자는 이전 실험을 통하여 한국산 야생 마우스 소뇌의 조롱박 세포의 수가 일반 마우스 소뇌의 조롱박 세포의 수보다 적게 발현되는 것을 관찰하였다. 본 실험 결과로 일반 마우스(Balb/c, ICR, C57BL/6) 소뇌 CZ과 NZ의 조롱박세포에서 3개의 parasagittal band의 Hsp25가 발현되는 것을 관찰하였다. 그러나 한국산 야생 마우스 소뇌에서는 Hsp25 발현이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 아마도 한국산 야생 마우스 소뇌 안에 조롱박 세포수의 감소와 신경돌기 결함에 의한 것임을 암시한다. Part Ⅱ- 운동실조 마우스에서의 HSP25의 발현 본 연구는 Pogo 마우스와 유사한 증상을 보이는 운동실조 마우스(Rolling Mouse Nagoya, Tottering, Leaner)와의 Hsp25 발현을 알아보았다. 위의 운동실조 마우스들의 공통된 특징은 염색체 8에 돌연변이와 심한 운동실조 그리고 간질을 보이는 특징을 가지고 있다. 본 실험 결과 일반 마우스 소뇌에서 관찰된 것과 같이 운동실조 마우스 소뇌 CZ과 NZ의 조롱박 세포에서 3개의 parasagittal band의 Hsp25가 발현되는 것을 관찰하였다. 그러나 Pogo 마우스 소뇌에서는 Hsp25 발현이 관찰되지 않았다. Hsp25 기능 중 하나는 스트레스 및 다양한 자극에 의해 손상된 세포를 보호하는 기능을 가지고 있다. 이러한 결과는 아마도 일반 마우스 및 운동실조 마우스에서는 Hsp25 기능이 정상적으로 유지하기 위하여 발현되나 Pogo 마우스에서는 세포 손상 시 손상된 세포를 보호하는 Hsp25 결여로 조롱박 세포 또한 감소했을 것으로 사료된다. Part Ⅲ- 한국산 야생 마우스 소뇌 발생과정에서 Hsp25의 출생 후 변화 본 연구는 한국산 야생 마우스 소뇌에서 발생 과정을 통하여 Hsp25 발현을 알아보았다. 본 연구자는 이전 실험을 통하여 일반 마우스(Balb/c, ICR, C57BL/6)와 운동실조 마우스(Rolling Mouse Nagoya, Tottering, Leaner)에서는 정상적으로 소뇌 CZ과 NZ의 조롱박 세포에서 3개의 parasagittal band의 Hsp25가 발현되는 것을 관찰하였다. 그러나 한국산 야생 마우스 소뇌에서는 Hsp25 발현되지 않아 우리는 출생 후 발생과정에서 Hsp25 변화를 확인하였다. 이미 발표된 내용으로 일반 마우스 출생 후 발생과정 소뇌에서 Hsp25 발현은 생후 3일령 에서는 AZ과 PZ에서 발현이 있었으며 생후 6-9일령 에서는 소뇌 전역에서 Hsp25 발현이 나타났다. 그리고 생후 12일령 에서는 CZ, PZ 그리고 NZ에서 발현을 보였으며 생후 15일령 이후에서는 성인 마우스에서와 같이 소뇌의 CZ과 NZ에서 발현되었다. 본 연구결과도 유사한 결과를 보였다. 생후 5일령 에서는 AZ, PZ에서 Hsp25 발현이 있었으며 그 이후 생후 18일령 까지는 점차 증가하다 생후 18일령 이후부터는 점차 발현이 감소하여 생후 35일령 에서는 Hsp25 발현을 볼 수 없었다. 단백질 정량을 통한 western blot를 통하여 면역조직화학 결과를 재확인 했다. 그러나 Hsp25의 mRNA를 확인하기 위하여 RT-PCR 실험을 해본 결과 모든 연령에서 mRNA가 관찰되었다. 이러한 결과는 mRNA에서 복제된 DNA가 단백질로 전환되지 못하는 translational이나 단백질 전환 후 발현에 영향을 줄 수 있는 post-transcriptional 변경에 의하여 Hsp25 발현이 나타나지 않는 것으로 사료된다. 이상의 연구결과는 한국산 야생 마우스 소뇌에서 Hsp25 발현을 출생 후 발생과정부터 확인하 Heat shock proteins (Hsps) are induced in response to a range of stressful stimuli, such as hyperthermia, immobilization, UV radiation, amino acid analogues, arsenite, various chemicals, and drugs. These proteins also have been suggested to have a role in protection against apoptotic cell death. Among them, the small heat shock protein, Hsp25 is known to be constitutively expressed in the mice cerebellum. The homozygote pogo (pogo/pogo) mouse is a novel neurological ataxic mutant, which is derived from an a Korean wild type mouse (KJR). The pogo/pogo mutant mice shows a mild Purkinje cell loss throughout the cerebellar vermis as well as the abnormal neurite morphology. In this study, we investigated the Hsp25 expression in normal, KJR mice and KJR derived ataxic mutant pogo/pogo mice using immunohistochemistry and western blot analysis. In normal mouse cerebellum, Hsp25 is expressed in a subset of Purkinje cells and the expression of Hsp25 is confined to two cerebellar regions: VI and VII (the central zone:CZ), IX, and X (the nodular zone:NZ). No Hsp25-immunoreactive band was observed in pogo/pogo, pogo/+ and KJR mouse cerebellum. These data suggest that Purkinje cell loss and neurite defects observed in pogo/pogo mice might be due to the absence of the constitutive Hsp25 expression. Heat shock proteins (Hsps) are induced in response to a range of stressful stimuli, such as hyperthermia, immobilization, UV radiation, amino acid analogues, arsenite, various chemicals, and drugs. Among them, the small heat shock protein, Hsp25 is known to be constitutively expressed in the mice cerebellum. The pogo/pogo mouse is a novel neurological ataxic mutant, which shows an ataxic gait, mild Purkinje cell loss throughout the cerebellar vermis as well as the abnormal neurite morphology. The pogo/pogo locus has been mapped to a region between D8Mit67 and D8Mit240 on chromosome 8. Among mouse mutants that have been mapped to that region are Rolling mouse Nagoya (RMN), tottering, and leaner. In this study, we explored the pattern of Hsp25 expression in homozygous (pogo/pogo), Rolling mouse Nagoya (RMN), tottering, and leaner mouse cerebellum using western blot analysis and immunohistochemistry. In the vermis, the central zone (CZ, lobule VI and VII) and nodular zone (NZ, lobule IX and X) of the cerebellar cortex contains parasagittal bands of Hsp25-immunoreactive Purkinje cells. However, there was no expression of Hsp25 in the pogo/pogo mouse cerebellum. We failed to observe any neuronal cell types which express Hsp25 in pogo/pogo. Western blotting analysis of cerebellar homogenates from pogo/pogo mouse confirmed the immunohistochemistry data. Western blotting analysis of cerebellar homogenates from pogo/pogo, Rolling mouse Nagoya (RMN), tottering, leaner mouse reveals that, consistent with the immunohistochemistry, no Hsp25 immunoreactive bands were observed in pogo/pogo. When cells are exposed to a range of stressful stimuli, including hyperthermia, various chemicals, and drugs, a set of proteins called heat shock proteins (Hsps) are induced. Among them, the small heat shock protein, Hsp25 is known to be constitutively expressed in the mice cerebellum. I investigated the expression of Hsp25 in the KJR mice which is derived from Korean wild type stock, named KJR (KJR/MsKist). Surprisingly, Hsp25 expression is completely diminished in KJR mice. In this study, I explored the Hsp25 expression during the postnatal stages of KJR mice development. Hsp25 immunoreactivity is first observed at postnatal 0 day and then gradually increased during postnatal 5, 10, 15 and 18 day in KJR mice cerebellum. From postnatal 18 day to 28 day, the expression of Hsp25 is begin to decrease. And on postnatal 35 day, Hsp25 immunoreactive Purkinje cells were not observed in the KJR cerebellum. Western blot analysis of cerebellar homogenates from KJR mouse cerebellum was performed and showed the consistent result with that of immunohistochemistry. Hsp25-immunoreactive band is initiated at postnatal 0 days (P0) and continued until the postnatal 18 days (P18). And then Hsp25 protein level was decreased from postnatal 20 days (P20) to postnatal 28 days (P28). By postnatal 35 days (P35), No Hsp25 immunoreactive band was observed. Using RT-PCR, no changes in Hsp25 mRNA expression level was observed in the KJR mouse throughout the development stage. The fact that Hsp25 mRNA is present (but no protein expression) after postnatal 30 day suggests an involvement of post-transcriptional or post-translational modification of Hsp25 protein.