감태(Ecklonia cava)의 생리활성 성분의 분리 및 정제

천세인 忠南大學校 新藥專門大學院 2019 국내석사

감태(Ecklonia cava)는 갈조류 다시마목 미역과에 속하는 해조류이다. 우리나라에서는 주로 남해안 및 제주도 해안 일대에 분포하였으나 수온 상승으로 울릉군 해안에서도 서식하고 있다. 선행연구에서 보고된 바로는 항산화,항염증,항균작용,혈당조절 등의 효능이 있는 것으로 알려져있다. 본 연구에서 사용한 감태는 제주도 해안에서 자란 감태 건중량 3 kg을 구입하였고, MeOH에서 상온추출 한 후, 40∘C 이상에서 감압추출한 추출물로 연구를 진행하였다. 다양한 column chromatography를 실시하여 이화학적 확인 및 구조동정을 위하여 1H-NMR, 13C-NMR, LC/MS 등 의 기기분석을 하였다. 그 결과 다음과 같은 감태의 주요 생리활성 성분인 7개의 플로로탄닌 성분을 분리 정제하였다. phlorolucinol, eckol, 7-phloroeckol, 6,6`-bieckol, 8,8`-bieckol, dieckol, phlorofucofuroeckol-A . Ecklonia cava is a seaweed belonging to the brown alga, laminariales (Lessoniaceae). Currently, many health functional foods utilized Ecklonia cava extract are available on the market. The major physiological effects of Ecklonia cava are reported, including antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial action, and blood sugar control. In this study, we tried to isolate characteristic components of the Ecklonia cava extract to be used as a health functional food material. Seven kinds of phlorotannin components including eckol were isolated and purified by various column chromatographies and as a result, phloroglucinol (1), eckol (2), 7-phloroeckol (3), 6,6'-bieckol (4), 8,8'-bieckol (5), dieckol (6), phlorofucofuroeckol-A (7) were obtained and identified by analyzing the spectroscopic analysis data such as 1H-NMR, 13C-NMR, LC/MS , etc.

Development of analytical method for CNC1049, a candidate for COVID-19 treatment, and application to pharmacokinetic study in rats

최해인 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

본 연구에서는 흰 쥐의 혈장에서 COVID-19 치료제 후보물질인 CNC1049에 대한 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS)을 개발하고 검증하였다. 흰 쥐의 혈장 중 CNC1049를 분석하기 위해 아세토나이트릴을 사용한 단백질 침전법을 통해 시료를 전처리 하였다. 흰 쥐의 혈장 중 CNC1049의 정량을 위하여 이동상은 10 mM Ammonium formate in DW와 아세토나이트릴의 조합으로, 분석용 컬럼은 역상으로서 페닐 컬럼을 이용하여 isocratic 용리방식으로 크로마토그램을 확인하였다. CNC1049 및 ibuprofen의 이온의 검출은 ESI negative MRM 모드로 진행하였고, CNC1049는 m/z 324.92 → 170.90 에서, ibuprofen은 m/z 205.06 → 161.10에서 두 채널을 동시에 정량 하였다. 혈장 중 CNC1049의 정량범위는 1 ~ 3,000 ng/mL 이었고, 양호한 직선성을 나타내었다. (r2>0.99). 해당 분석에서 CNC1049는 0.77분, ibuprofen은 0.71분의 피크유지시간을 나타내었으며 분석물질이 혈장중 내인성물질과의 간섭 없이 일정한 피크유지시간을 나타냄을 확인하였다. 일내, 일간 정밀성(%CV) 및 일내, 일간 정확성(%RE)은 모두 8% 미만으로 확인되었다. 또한 생체시료의 영향, 회수율, 전처리 효율은 77 ~ 96%였다. 시료 취급(3회 냉·해동, 실온에서 6시간, -20℃에서 한 달, 전처리 후 24 시간)에 따른 CNC1049의 안정성을 평가한 결과, 상기의 조건에서 99.9%이상의 높은 안정성을 보였다. 개발된 CNC1049의 분석법은 FDA 분석법 및 EMA 가이던스 기준을 충족 하였고, 재현성 있고 신뢰성 있는 분석결과를 얻을 수 있음을 확인하였다. CNC1049의 체내 동태 연구는 각각 0.3 ~ 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 정맥, 경구 및 근육투여 후 평가되었다. 정맥 투여 후, 반감기, 클리어런스, 분포용적은 대략 각각 1 h, 1,000 mL/h/kg, 300 mL/kg로 용량에 상관없이 일정한 값을 나타내었다. 경구 투여 후, 생체 이용률은 5.5%로 추정되었고 체내 약물의 노출은 매우 낮았다. 근육 주사 후, 생체 이용률은 65%로 경구 투여군에 비해 비교적 높은 값을 나타내었다. 흰 쥐에서 CNC1049 300 mg/kg로 경구 투여 후 조직분포실험의 경우, 14 개의 조직 (뇌, 간, 신장, 비장, 위장, 소장, 대장, 고환, 지방, 폐, 심장, 부신, 피부 및 근육)에서 CNC1049는 소화관을 제외하면 주로 부신과 신장에 높게 분포하였다. CNC1049의 배설연구는 흰 쥐에 3 mg/kg로 정맥투여하거나 10 mg/kg로 경구투여 함으로써 진행되었으며, 소변과 대변을 통한 CNC1049의 회수율은 6 % 미만이었다. 한편 in vitro 연구에서 CNC1049가 흰 쥐의 간 마이크로솜에서 반감기가 30분 이내로 불안정했으나, 1상대사가 주요 대사경로가 아님이 예측되었다. CYP 효소 주요 5종(1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4) 중 CYP2C9을 약하게 저해했으며, 마우스, 흰 쥐, 개, 원숭이, 사람의 혈장에서 99.8% 이상의 높은 혈장단백결합률을 보였고 종 간 차이는 없는 것으로 확인되었다. 결론적으로, HPLC-MS/MS를 이용하여 흰 쥐의 혈장에서 CNC1049를 정량하는 분석법을 개발 및 검증하였고, 이 분석법은 흰 쥐에서의 약물동태 연구에 잘 적용되었다.

LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에 대한 정금나무 가지 추출물의 항염증 효과

윤민지 충남대학교 신약전문대학원 2020 국내석사

This study was performed to investigate the anti-inflammatory effect of Vaccinium oldhamii branches extract in lipopolysaccharides (LPS)-induced RAW 264.7 cells. In order to confirm the anti-inflammatory effect, the nitric oxide (NO) production, which is a representative indicator of inflammmation, was measured, and then the expression of proteins and mRNA of inflammatory enzymes inducible nitric Oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase 2 (COX-2) were measured. As a result, hexane and ethyl acetate fractions showed the highest anti-inflammatory activity by inhibiting NO production of respectively 69.0% and 48.4% at 50 μg/mL. In addition, The expression of iNOS protein and mRNA were significantly inhibited. COX-2 significantly inhibited mRNA expression, but there was no significant difference in protein expression. Furthermore, The secretion of interleukin 6 (IL-6), which is an inflammatory cytokine observed as high concentrations in rheumatoid arthritis (RA), were significantly inhibited. And mRNA expression was also inhibited. The inhibitory effect of Janus kinase (JAK), a major signaling pathway of cytokines, was measured by biochemical assay. The inhibitory effect was confirmed only in ethyl acetate fractions. These results indicate that hexane and ethyl acetate fractions of Vaccinium oldhamii branches have anti-inflammatory effect. Especially ethyl acetate fractions may exert anti-inflammatory activity through the inhibiting JAK signaling. Therefore, Vaccinium oldhamii branches extract has potential as a therapeutic agent for inflammatory diseases including rheumatoid arthritis.

New protein- and ligand-based approaches using topological water network and chemical fingerprint

최광은 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내박사

컴퓨터를 활용한 신약 설계 연구분야는 크게 구조기반 약물설계, 리간드기반 약물설계 방법으로 나뉘어져 있다. 이러한 연구기법을 활용해 약물활성 예측을 잘 하기 위한 분자들의 수학적, 논리적 데이터형으로 나타낸 특성들을 descriptor(표현자)라고 한다. 단백질기반의 표현자들은 아미노산서열, 리간드와의 결합에너지, 용매화 자유에너지 등이 있으며, 리간드 기반의 표현자들은 분자량, 분배계수, 수소결합 공여체 및 수용체 수, 방향족 고리 수, 극성표면영역, substructure와 작용기를 논리값으로 나타내는 화학 핑거프린트 등이 있다. 오늘날 유용한 표현자들을 계속해서 식별, 개발, 개선하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에선 기존에 좀처럼 활용하지 않았던 신규 표현자들을 적용하였다. 단백질 기반의 표현자로서 원자 수준에서의 위상학적 물분자 네트워크를 이용하고, 리간드 기반의 표현자로서 정수형 화학 핑거프린트를 이용하였다. 단백질 기반의 표현자로는 이전에 단백질과 리간드만 고려한 연구방법에서 물분자를 도입한 연구방법으로 확장되고 있다. 그러나 물분자를 이용한 연구방법은 대부분 자유에너지 계산을 이용하며, 이러한 자유에너지 계산은 많은 시간을 요구하고 개개의 물분자만을 고려한다. 본 연구에선 자유에너지 계산 없이 다른 물분자들과의 물리화학적 성질을 나타낼 수 있는 위상학적 물분자 네트워크를 도입하였으며, 고리(ring)형 구조를 나타내는 3-, 4-, 5-, 6-ring 을 추출하여 이용하였다. 원자 수준에서의 위상학적 물분자 네트워크 분석은 각각 20개의 아미노산 구조를 생성해서 분자동역학 시뮬레이션 결과에 적용했으며, 고분자 중합체인 단백질은 X-선 결정 구조로 규명된 12만개의 모든 실험적 단백질 3차구조 파일을 다운로드하여 분석하였다. 친수성 아미노산은 극성 원자인 산소, 질소 주변에 물 네트워크를 형성하였고, 소수성 아미노산은 비극성 원자인 탄소 주변에 물 네트워크를 형성하였다. 리간드 기반의 표현자로는 대부분 이진수형 핑거프린트를 이용하여 연구가 진행되고 있다. 그러나 이진수형 핑거프린트는 일정한 수 (보통 1024개)로 고정되어 있어 분자들의 수많은 substructure, 작용기들을 모두 표현하는 것이 제한된다. 따라서 정수형 핑거프린트를 새로 도입하여 hERG 저해제 예측에 적용하였다. 정수형 핑거프린트는 대부분의 머신러닝 모델에서 잘 예측하며 이진수형 핑커프린트는 딥러닝 모델에서 잘 예측하고 변수들의 수가 1024개로 고정되어 있어서 계산시간이 단축되었다. 생성한 모델들의 성능 비교 결과 데이터 수가 적은 조건 (최근 2019년 개제된 hERG 실험결과 문헌들)에서의 예측력은 머신러닝, 딥러닝 모두 정수형 핑거프린트에서 잘 예측하였다. 상기 신규 표현자들의 활용은 컴퓨터 기반 신약 설계분야에 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대한다.

Decursinol의 뇌 내 항염증 효능 및 약동학적 특성

남윤채 충남대학교 신약전문대학원 2022 국내석사

Decursinol, a coumarin derived from Angelica gigas Nakai, has been known to possess anti-nociceptive, anti-metastatic, and anti-inflammatory effects. The purpose of the present work is to study the pharmacological effects and tissue distribution of decursinol in the brain. It markedly suppressed at concentration of 30, 100 μM of decursinol in LPS-induced NO, TNF-α, and IL-6 production, in BV2, a microglial cell line, suggesting the anti-inflammatory effect of decursinol in the brain. It showed extremely high permeability (Papp > 30×10-6 cm/sec) in MDCK-MDR1 cell monolayer and the efflux ratio was 0.8. After oral administration at doses of 20 mg/kg in male mice, it was distributed fastly (Tmax of 1h) and well (Kp of 0.69, Kp,uu of 0.31) to the brain. Our results show that decursinol exhibits anti-inflammatory activity and good pharmacokinetic properties as a therapeutic drug candidate for inflammatory brain diseases.

Identification of Binding Mode Using Computational Methods for Two Distinct Targets : Arabidopsis thaliana 7-Keto-8-Amino Pelargonic Acid Synthase (AtKAPAS) and Human Coagulation Factor XI

조재은 충남대학교 신약전문대학원 2013 국내석사

신약 개발에서 컴퓨터 기반 분자 설계의 방법은 거시적으로 화합물 기반의 분자 설계 (ligand based drug design; LBDD) 와 구조 기반의 분자 설계 (structure based drug design; SBDD)로 분류할 수 있다. 화합물 기반의 분자 설계의 방법은 알려진 리간드의 정보를 활용하여 모델을 구축하는 반면에 구조 기반 분자 설계의 경우, X-ray crystallography 혹은 NMR 등의 실험을 통하여 얻어진 타겟 단백질의 삼차원적 구조를 기반으로하여 선도 물질을 설계한다. 실험적으로 밝혀진 단백질의 삼차원 구조가 없을 경우에 단백질의 알려진 서열 정보를 활용하여 homology model (예측된 삼차원 구조)를 설계 할 수 있다. 본 연구는 두 가지 서로 다른 타겟, Arabidopsis thaliana 7-Keto-8-Amino Pelargonic Acid Synthase (AtKAPAS) 와 human coagulation factor XI (FXI)를 활용하여 결합 모드를 구축하고 도킹 및 구조 기반의 3차원적인 정량적 구조-활성관계 (3D-QSAR) 연구를 수행함으로 예측력이 높은 모델을 만들고자 하였다. AtKAPAS 는 biotin의 생합성에 관여하며 AtKAPAS 를 억제 시켰을 때 치사 표현 형질을 보이는 신규 제초제 작용점이다. AtKAPAS 의 서열 정보를 이용하여 구축된 homology model 로 구조 기반의 분자 설계 기법인 도킹을 수행 하였다. 단백질 활성 자리 잔기들의 움직임을 고려하지 않고 rigid docking 을 수행하였을 때, 의미 있는 결과를 얻지 못하였으나, 활성 자리 특정 잔기, Lys 312와 Phe 192의 flexibility를 고려한 flexible docking을 수행 하였을 때 각각 0.72 와 074 의 r2값을 가지는 의미 있는 모델을 산출하였다. Human coagulation factor XI 은 출혈 부작용이 적은 혈전 치료제 타겟으로 이미 알려진 Human FXI 의 삼차원 단백질 구조를 활용하여 구조 기반 3D-QSAR를 수행 하였다. 도킹을 통하여 얻은 두 가지의 서로 다른 방향 (S1-S1’-S1’과 S1-S2-S4)의 결합 모드를 바탕으로 하여 각각 3D-QSAR 연구를 진행하였다. 3D-QSAR연구는 크게comparative molecular field analysis (CoMFA)와 comparative molecular similarity indices analysis (CoMSIA) 방법을 사용하여 수행되었다. Partial least squares (PLS) 통계 분석은 S1-S1’-S2’의 경우에 각각 0.99와 0.96의 r2을 가지는 모델을 산출 하였으며 단백질 억제 활성에 대한 결합 에너지의 의미 있는 내부 예측력 (r2pred = 0.93 and 0.83)을 나타내었다. S1-S2-S4 결합 모드에 대한 CoMFA, CoMSIA 의 PLS 분석 결과 각각 0.99 와 0.97로 좋은 예측력을 보였으나 내부 예측력 (r2pred = 0.08 and 0.36) 은 다소 떨어졌고, 세 개의 특이점 (outliers)을 제거 했을 때 내부 예측력이 0.97로 상승하는 의미 있는 결과를 나타냈다. 특이점을 분석한 결과, S2 site와 결합을 형성하는compound 잔기가 bulky한 경우와 catalytic site와 결합을 형성 하는 amide bond에 부피가 큰 fragment 가 붙을 경우에 단백질과 결합이 깨지게 되어 예측력을 잃게 됨을 밝혔다. 이 논문에서는 두 가지 타겟에 대한 단백질의 구조를 기반으로 도킹 및 3D-QSAR을 수행함으로 결합 모두를 구축하고 화합물의 구조와 활성의 상호 관계를 분석하기 위한 예측 모델을 산출 함으로써 본 타겟에 대한 신규 화합물의 개발에 기여하고자 하였다. In this study, we investigated the binding mode of compounds obtained from in-house library using computational docking and 3D-QSAR studies. Two different targets, Arabidopsis thaliana 7-keto-8-amino pelargonic acid synthase (AtKAPAS) and human coagulation factor XI are utilized for this research. The AtKAPAS, introduced in this research, is a novel herbicide target which is involved in the early steps of the biotin biosynthesis pathway. Since biosynthetic steps of biotin exist only in plants, we expect that the inhibition of the potent target AtKAPAS will not affect the human metabolic system by any means. Inhibiting AtKAPAS leads to significant changes in the phenotypes of A. thaliana, such as growth inhibition, severe growth retardation and the creation of lethal phenotypes. We carried out the study of the three dimensional structure of AtKAPAS by homology modeling and the binding mode of compounds obtained from in-house library using computational docking methods. From the flexible docking study, we achieved high docking scores for the active compounds denoted in this study as compound 3 and 4. Thus, we highlight the flexibility of specific residues, Lys 312 and Phe 172, in active sites. For the further work, we will optimize compound 3 and compound 4 using this homology model for AtKAPAS. The human coagulation factor XI (FXI), a serine protease that plays a significant role in the intervention of the blood coagulation cascade, is an attractive antithrombotic target. Selective inhibition of FXIa (an activated form of factor XI) disrupts the intrinsic coagulation pathway without affecting the extrinsic pathway or other coagulation factors such as FXa, FIIa, FVIIa. Furthermore, targeting the FXIa might significantly reduce bleeding side effects and improve the safety index. This thesis reports on a docking based three dimensional quantitative structure activity relationship (3D-QSAR) study of the potent factor XIa inhibitors, the chlorophenyl tetrazole scaffold series using comparative molecular field analysis (CoMFA) and comparative molecular similarity analysis (CoMSIA) models. Due to the unique binding site of FXIa, we classified the alignment of the known FXIa inhibitors into two groups according to the docked pose: S1-S2-S4 and S1-S1’-S2’. Consequently, our highly predictive 3D-QSAR models will provide insight for designing new potent FXIa inhibitors.

난발현성 단백질 Cathepsin K 발현 및 정제

박슬기 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

Cathepsin K is an enzyme Protein expressed in osteoclasts, and causes osteoporosis by decomposing elements that make up the bone matrix such as elastin, collagen, and gelatin. Therefore, the development of Cathepsin K inhibitors could suggest a therapeutic approach to osteoporosis. In this study, Cathepsin K gene cloning was performed in several formats to obtain Cathepsin K antigen. Thereafter, transfection was performed on HEK293Ecell, a mammallian cell, and the expression level was confirmed through western blot. Since it was estimated that the expression level of Cathepsin K, a Cysteine protease was toxic to the cell, and the expression level was low, three amino acids (Cysteine, Histidine, Asparagine), which play an important role in activating the hydrolysis of Cathepsin K, were point mutations to Alanine. Of these three amino acids, only point mutation of Cysteine to Alanine increased the expression level. In order to further increase the expression level, Signal Peptide Screening from No.1 to No.200 for this format performed. As a result, the expression level was the best in Signal Peptide No.135, and N-NTA affinity chromatography was performed to obtain Cathepsin K antigen for this type. However, a fine amount of protein was expressed and was not neatly separated or purified. As a conjecture, a G4S linker, which makes the protein flexible, was constructed between the target gene and the His-tag, considering whether the protein does not bind to His-tag. In the same manner as above, after cloning Signal Peptides 1 to 200, Ni-NTA affinity chromatography was performed to obtain antigens. As a result, it was confirmed that the expression level was improved compared to before attaching the G4S linker. In order to efficiently obtain Cathepsin K antigen from the economic point of view, a test was conducted using BL21-DE3 as a cell line in E.coli, not a mammallian cell. After growing in E.coli in large quantities, cell sonication was performed to confirm which of the supernatant and pellets was highly expressed. As a result, it was identified as an inclusion body expressed in pellets. After purification to separate the inclusion body by adding urea, refolding to remove urea was performed again. In these process, the column was not eluted to see if the protein was denaturated. As a result, it was difficult to obtain an antigen from E.coli, and Cathepsin K antigen was obtained by culturing mammallian cells. Cathepsin K는 파골세포(Osteoclast)에서 발현되는 enzyme protein으로서 elastin, collagen, gelatin과 같은 뼈의 기질을 이루는 요소들을 분해시켜 골다공증(Osteoporosis)를 유발한다. 따라서 Cathepsin K 억제제 개발은 골다공증의 치료적 접근법을 제시 할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 본 연구에서는 항체 개발을 위한 전 단계로 Cathepsin K 항원을 얻기 위하여 여러 형식 Cathepsin K gene 클로닝을 진행하였다. 경제적인 면에서 효율적으로 Cathepsin K 항원을 얻기 위하여 mammallian cell이 아닌 E.coli에서 BL21-DE3를 cell line으로 하여 test를 진행하였다. E.coli에서 대량으로 키운 후 cell sonication을 진행하여 Supernatant와 Pellet중 어느곳에서 발현이 많이 되는지 확인하였다. 그 결과 Pellet에서 발현이 되는 Inclusion body로 확인되었다. Urea를 첨가하여 Inclusion body 를 분리하기 위하여 정제를 진행한 후 다시 urea를 제거해주는 Refolding을 진행하였는데 이 과정에서 단백질이 denaturation된 것인지 컬럼에 Elution 하지 않았다. 이후 mammallian cell인 HEK 293Ecell에 transfection을 진행하였고 western blot을 통하여 발현량을 확인한 결과, 원하는 발현량을 얻을 수 없었다. Cysteine protease인 cathepsin K가 cell에 toxic하여 발현량이 낮은 것은 아닌지 추측하였기 때문에cathepsin K의 가수분해를 활성화 나타내는데 중요한 역할을 하는 아미노산 3개(Cysteine, Histidine, Asparagine)를 Alanine으로 point mutation을 진행하였다. 이 3가지 아미노산 중 cysteine을 alanine으로 point mutation 시킨 것만 발현량이 증가한 것으로 보아 추측이 옳았음을 알 수 있었다. 발현된 단백질을 세포 바깥으로 분비하도록 하는 체계를 만들고자 1번부터 200번까지의 Signal Peptide Screening을 진행하였다. 그 결과 Signal Peptide 135번에서 발현량이 가장 우수하였고 이에 대한 catehpsin K 항원을 얻기 위하여 Ni-NTA Affinity Chromatography를 진행하였다. 그러나 미세한 양의 단백질이 발현되었고 깔끔하게 분리, 정제 되지 않았다. 이에 대한 추측으로 단백질이 His-tag에 binding 하지 않는 것인지 생각하여 단백질을 Flexible하게 만들어주는 G4S Linker를 target gene과 His-tag 사이에 제작하였다. 위와 동일하게 Signal Peptide 1번부터 200까지에 대한 클로닝을 진행한 뒤 항원을 얻기 위하여 Ni-NTA Affinity Chromatography를 진행하였다. 그 결과 G4S Linker를 부착하기 전에 비하여 발현량이 개선된 것을 확인 할 수 있었다. 결과적으로 E.coli에서 항원을 얻기는 힘들었고 mammallian cell을 배양하여 Cathepsin K 항원을 얻을 수 있었다.

Development of HPLC-MS/MS method for CNC1101, a PARP inhibitor, and application to rat pharmacokinetic study

이승원 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

본 논문에서는 흰 쥐의 혈장 중 건성 황반 변성 치료제 후보물질인 CNC1101에 대한 흰 쥐에서의 약동학 연구에 앞서 HPLC-MS/MS 분석 방법을 확립하고 검증하고자 하였다. 분석을 위한 기기에는 애질런트사의 고성능 액체 크로마토그래피 1100 series, 질량분석기로 API4000 장비가 사용되었다. CNC1101의 분석을 위한 이동상은 5 mM ammonium acetate가 포함된 distilled water와 acetonitrile를 사용하였다. CNC1101은 m/z 391.19 → 204.1, IS로 사용된 CNC1102는 m/z 405.21 → 218.1에서 분석되었다. 시료의 분리에는 C8 컬럼과 C8 가드 컬럼의 조합을 사용하였다. 이러한 조건으로 분석하였을 때 CNC1101과 CNC1102은 내재물질의 어떠한 간섭없이, 반복 분석 시에도 일정하였다. CNC1101은 3.91-1,000 ng/mL 사이에서 양호한 직선성을 보였고 일내 정확성과 일간 정확성은 각각 10.4%, 9.7% 내외, 일내 정밀성과 일간 정밀성은 각각 7.0%, 10.4% 내외로 산출되었다. 또한 CNC1101의 생체시료효과는 흰 쥐의 혈장에서 73.5%-82.4%, 회수율은 105.9%-107.8%, 전처리 방법의 효율성은 79.2%-87.8% 내외로 산출되었다. CNC1101은 -20℃에서 4주까지 안정하였으며 6시간 실온 방치 또는 3번의 냉해동 반복시에도 안정하였다. 모든 FDA 가이던스의 기준을 충족하여 이 분석방법이 적절하고 재현성 있음을 시사하였다. In vitro 시험으로는 약물-약물 상호작용을 평가하기 위한 지표로서 CYP450 효소 억제 실험과 혈장 단백 결합실험이 수행되었다. CNC1101은 CYP3A4을 저해하였고, IC50 값은 0.16 μM로 산출되었다. 또한 CNC1101은 혈장단백질에 강하게 결합하였고, 종간의 차이는 보이지 않았다. In vivo 실험에서는 웅성 7주령 흰 쥐를 사용하여 1, 3, 10 mg/kg로 꼬리 정맥을 통해 단회 투여하였고, 3 mg/kg로 단회 경구 투여하였다. 또한 0.1% 용액을 제공받아 0.1 mg/kg로 단회 점안과 정맥 투여하였다. CNC1101은 1-10 mg/kg의 정맥 투여용량 범위 내에서 용량에 비의존적인 약동학 양상을 보였다. 설치류 기준으로 생체 이용률은 경구 투여시에는 높은 수준이나 점안 투여 시에는 보통 수준으로 나타났다. 경구 투여 후 CNC1101이 가장 많이 분포한 장기는 부신과 간이었고, 점안 투여 시에는 안구와 부신이었다. CNC1101은 모약물로서 10% 내외로 분변과 뇨를 통해 배설되었고, 이는 CNC1101의 주요 대사 경로가 1상 대사 외 다른 대사 경로임을 시사한다. 0.1% 용액을 단회 점안 투여 후의 SD rat의 안구조직 분포 실험에서는 CNC1101은 안구를 가로지르는 분포 뿐 아니라 공막을 통한 분포의 가능성을 보여주었다. 결론적으로, CNC1101에 대한 적절한 HPLC-MS/MS 방법을 개발 및 검증하였고, 이를 성공적으로 흰 쥐에서의 약동학 연구에 적용하였다.

Bioequivalence Study on Strategic Development of Generic Drugs

윤재남 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내박사

As the world's aging population and increasing medical expenses are emerging as social issues, the use of generic drugs with the same ingredients and efficacy as the original drugs and relatively low costs is being encouraged at the national level. Due to this trend, the generic drugs market is also continuously increasing worldwide. Thus, the development of generic drugs that can be developed in a short period of time at low costs and that can achieve a short-term increase in sales, is considered essential in the current pharmaceutical market. Therefore, in this study, it was investigated and analyzed the development status of generic drugs, drug approval system, pharmaceutical pricing system, and bioequivalence test in the US, Europe, and Korea, and applied it to bioequivalence tests for actual development case of generic drugs. Also, through this, it would like to propose a strategy for developing generic drugs. Global generic drug market is continuously growing at an annual average growth rate of four to seven percent. In the United States, Japan, and Korea, bioequivalence test data must be submitted for approving generic drugs. The bioequivalence test is performed with statistically calculated number of subjects, and 2×2 crossover design between original drug and test formulation. The results assess logarithm conversion values of AUCt (Area Under Concentration-time curve) and Cmax (the peak concentration) among the bioavailability obtained though bioequivalence test. If the 90% confidence interval for the difference in this values between original drugs and test formulations falls within (log (0.8), log (1.25)), the two formulations are biologically equivalent. In this study, it analyzed bioequivalence tests of actual development cases of generic drugs. The first case was developed as a strategy to avoid the substance patent of the original drug by changing salt. The original drug contains 300 mg of tenofovir disoproxil fumarate, and test formulation contains 245 mg of tenofovir disoproxil, a free base. As a result, 90% confidence interval for Cmax, AUClast and AUCinf among the pharmacokinetic parameters ranged from 80% to 125%. In the second case, to increase the patient's compliance with the medication, a combination drug was developed with bazedoxifene and cholecalciferol, and a bioequivalence test was performed with each component. It was confirmed that the 90% confidence interval for Cmax, AUC0-t and AUCinf ranged from 80% to 125%. Based on these development cases of generic drugs, the strategy of avoiding patents due to salt change is development methods aiming at the time of product release, and the strategy of developing a combination of two or more active ingredients is to increase the market competitiveness by increasing medication compliance. Overall, strategy for developing generic drugs is to develop differentiated products. Pharmaceutical companies should strive to discover excellent generic candidates, focusing on products that have promising growth capabilities, marketing capabilities and commercialization possibilities for each company. 전세계적으로 인구 고령화와 의료비 증가가 사회적 문제로 대두됨에 따라 오리지널 의약품과 성분 및 유효성이 동일하면서 상대적으로 가격부담이 적은 제네릭 의약품 사용을 국가 차원에서 장려하고 있으며, 이로 인해 제네릭 의약품 시장도 전세계적으로 지속적으로 증가하고 있다. 따라서 단기간, 저비용으로 개발 가능하며 단기간 매출 증대를 이룰 수 있는 제네릭 의약품 개발은 현재 제약 시장에서 필수로 여겨진다. 따라서, 본 연구에서는 미국, 유럽 및 국내의 제네릭 의약품 개발 현황과 허가제도를 조사분석하고, 제네릭 의약품 허가를 위한 생물학적 동등성 시험에 대한 이해를 통해 실제 제네릭 의약품 개발을 위한 생물학적 동등성 시험에 적용하여 분석해보았다. 또한, 이를 통하여 제네릭 의약품 개발 전략을 제안해 보고자 한다. 전세계 제네릭 의약품의 시장규모는 연평균 4-7%의 성장속도로 지속적으로 성장하고 있다. 미국, 일본 뿐만 아니라 한국은 제네릭 의약품 허가 신청 시 생물학적 동등성 시험 자료를 제출해야 한다. 생물학적 동등성 시험은 통계적으로 산정한 시험자수로 오리지널 의약품과 개발중인 시험약을 가지고 2×2 교차시험을 통해 얻어진 생체 이용률 지표 중 AUCt (Area Under Concentration-time curve)와 Cmax (the peak concentration)의 로그 변환 값의 차이에 대한 90% 신뢰구간이 (log (0.8), log (1.25)) 안에 포함되면 두 제제는 생물학적으로 동등한 것으로 판정한다. 본 연구에서는 실제 제네릭 의약품 개발을 위해 수행한 생물학적 동등성 시험에 대해 연구하였다. 첫번째는 염을 변경하여 오리지널 의약품의 물질특허를 회피하는 전략으로 개발되었다. 오리지널 의약품은 Tenofovir disoproxil fumarate 로서 300 mg을 함유하고, 시험약은 free base인 Tenofovir disoproxil 로서 245 mg을 함유한다. 시험 결과, PK 파라미터 중 로그변환한 Cmax, AUClast 및 AUCinf에 대한 90% CI 값은 80-125% 범위 내였다. 두번째는 환자의 복약 순응도를 높이기 위해 bazedoxifene 및 cholecalciferol 가지고 복합제로 개발하여 각 성분의 생물학적 동등성 시험을 수행한 결과, 로그 변환된 Cmax 및 AUCt의 90% CI 값은 80-125% 범위 내였다. 이러한 제네릭 의약품의 개발 사례는 염변경으로 특허를 회피하는 전략으로 의약품 출시 시점을 목표로 개발하는 방법이며, 기존의 두가지 이상의 성분을 복합제로 개발하는 전략은 복약 순응도를 높여 시장 경쟁력을 높이는 방법이다. 종합적으로 제네릭 의약품의 개발 전략은 차별화된 제품을 개발하는 것이다. 제약회사는 기업별 특화된 마케팅 능력 및 제품화 가능성, 성장 가능한 우수 품목을 중심으로 우수 제네릭 후보 품목 발굴에 힘써야 한다.

Discovery of TrkA Inhibitor for the Cancer Treatment using Bayesian Machine Learning and Docking Method

강성일 충남대학교 신약전문대학원 2021 국내석사

The tropomyosin receptor kinase (Trk) family enzymes, belonging to the transmembrane receptor tyrosine kinases superfamily, are primarily expressed in human neuronal tissues to regulate the mammalian nervous system (1). The Trk family consists of three subtypes, TrkA, TrkB, and TrkC, being activated by a specific ligand (2). Among the Trk family, TrkA is the most commonly identified oncogene, found in a proportion of about 7.4% in several tumor types (0.4% for TrkB and 3.4% for TrkC, respectively)(3). Moreover, TrkA has also been shown to mediate stimulation of early tumor progression (4). However, Trk inhibitors are known to have side effects on the central nervous system (CNS) by penetrating the blood brain barrier (BBB) (3). Therefore, blocking TrkA signaling is considered an attractive clinical approach for cancer treatment. In this study, we intend to explain a method of finding a hit compound inhibition TrkA using a computer-assisted drug design (CADD). There are two methods of CADD: ligand-based drug design (LBDD) and structure-based drug design (SBDD). Among the LBDD methods, a Bayesian model was used for the quantitative structure-activity relationship (QSAR) method. The SBDD method used molecular docking studies. Bayesian models were created using compounds with known in vitro assay results. The generated bayesian model was verified through the comparison with in vitro biological activities of the compounds and the tendency of the compounds bayesian score. In-house library screening was performed to find TrkA inhibition hit compound using the verified bayesian model. Also, we predicted the binding mode of the screened compounds through molecular docking study. And then, pKa and LogP values of the compounds were predicted via ACD could penetrate prediction program to determine whether the selected hit compound penetrated the Blood-Brain Barrier (BBB). As a result, we expect those compounds didn’t have a BBB penetration issue. Therefore, the selected hit compound can be developed as inhibitors of TrkA by performing optimization steps with new scaffolds. In this study, the compounds screening was performed using the QSAR model of the LBDD method. In addition, the binding mode of the screening compound was predicted through molecular docking studies. As a result, we discovered a hit compound of TrkA, which is highly related to tumors. Through this, the CADD technique using LBDD and SBDD are expected to provide many advantages in the process of discovering new drug. 트로포마이오신 수용체 키나아제 (Trk)의 구성은 트로포마이오신 키나아제 A (TrkA), 트로포마이오신 키나아제 B(TrkB), 트로포마이오신 키나아제 C (TrkC)로 분류된다. Trk family중에서 TrkA는 여러 종양 유형에서 약 55.8%의 비율로 다른 Trk 아이소타입에 비해 종양과 연관성이 높은 것으로 보고되어 있다. TrkA와 연관 있는 대표적인 암종으로는 폐 (폐 선암), IC (내부 담관암), PTC (유두 갑상선암) 및 Glio (교 모세포종) 등이 있다. 그러나 알려진 Trk inhibitor는 BBB 투과하여 CNS (중추신경계)에 부작용을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서 이번 연구에서는 여러 종양과 연관성이 있으며 부작용이 적은 약물이 필요한 TrkA를 타겟으로 선정하였다. 본 연구에서는 computer-assisted drug design (CADD)을 이용하여 TrkA에 대한 hit compound를 찾는 방법을 설명하고자 한다. CADD는 ligand-based drug design (LBDD) 와 structure-based drug design (SDBB) 방법이 있다. LBDD의 여러 방법 중에서 quantitative structure-activity relationship (QSAR) 방법을 선택하였고 그 중에서 bayesian model 이용하였으며, SBDD 방법에서는 Molecular docking studies 활용하였다. Bayesian model의 생성은 in-vitro assay 결과값이 알려진 화합물을 이용하여 model을 생성 하였으며, 모델의 검증은 in-vitro assay 결과를 통해 활성과 bayesian model의 경향성을 바탕으로 검증하였다. 검증된 bayesian model을 이용하여 타겟인 TrkA의 hit compound를 찾고자 in-house library screening을 하였다. Screening된 compound는 molecular docking study를 통해 binding mode를 예측하였다. 선별된 hit compound의 BBB 투과 여부 예측은 ACD program을 이용하여 pKa 와 LogP 예측하였고, 또한 선별된 hit compound는 새로운 scaffold를 가짐으로써 최적화 단계를 진행한다면 TrkA의 억제제로 개발 가능할 것으로 판단된다. 이번 연구에서 LBDD 방법 중 QSAR 모델을 이용한 compound screening 와 SBDD 방법 중 molecular docking study를 이용하여 screening compound의 binding mode 예측하였다. 그 결과 종양과 연관성이 높은 TrkA의 hit compound를 찾았다. 이를 통해 LBDD, SBDD를 이용하는 CADD 방법이 drug discovery 과정에서 많은 이점을 줄 수 있을 것이라 기대한다.