Generation of Transgenic Rice without Antibiotic Selection Marker through Agrobacterium-mediated Co-transformation System

Soo-Kwon Park(박수권),Tackmin Kwon(권택민),Jong-Hee Lee(이종희),DongJin Shin(신동진),Woon-Ha Hwang(황운하),You-Chun Song(송유천),Jun-Hyun Cho(조준현),Min-Hee Nam(남민희),Seung-Ho Jeon(전승호),Sang-Yeol Lee(이상열),Dong-Soo Park(박동 한국생명과학회 2012 생명과학회지 Vol.22 No.9

작물의 수확량이나 병 저항성을 증가시키는 형질전환 식물체 개발은 세계 식량 부족을 해결하는 좋은 방법이다. 하지만 항생제나 제초제의 사용은 형질전환 작물의 안전에 대해서 일반 사람들의 심각한 우려를 초래한다. 본 연구에서는, 아그로박테리움을 이용한 동시 형질전환 방법을 이용하여 한국의 밀 재배종인 ‘조경밀’의 유전자인, 고분자 글루테닌 서브유닛[high molecular-weight glutenin subunit (HMW-GS)] Dx5가 삽입된 마커프리 형질전환벼를 개발하였다. 각각 Dx5 유전자와 하이그로마이신(HPTII) 저항성 유전자만으로 구성된 두 종류의 발현 카셋트(Two expression cassettes)를 독립적으로 아그로박테리움 EHA105에 도입하였고, Dx5와 HPTII가 도입된 각각의 EHA105 아그로박테리움을 3:1 비율로 혼합하여 벼 캘러스에 접종하였다. 66개의 HPTII 저항성 형질전환체 중에서 벼 게놈에 Dx5와 HPTII가 모두 삽입된 2개의 형질전환 라인을 획득하였다. Dx5와 HPTII가 벼 게놈에 도입된 것을 Southern blot을 통해서 다시 확인하였다. 또한, semi-quantitative RT-PCR을 통해 형질전환벼 T1 세대 종자의 밀 Dx5 전사여부를 확인하였고 결국, Dx5 유전자만을 가지는 마커프리 형질전환벼를 T1 세대에서 선발할 수 있었다. 본 연구 결과는 두 종류의 발현 카셋트를 사용한 아그로박테리움 동시 접종 시스템이 마커프리 형질전환벼를 생산하기 위한 효과적인 전략이 될 수 있음을 보여준다. Development of transgenic plant increasing crop yield or disease resistance is good way to solve the world food shortage. However, the persistence of marker genes in crops leads to serious public concerns about the safety of transgenic crops. In the present paper, we developed marker-free transgenic rice inserted high molecular-weight glutenin subunit (HMW-GS) gene (Dx5) from the Korean wheat cultivar ‘Jokyeong’ using Agrobacterium-mediated co-transformation method. Two expression cassettes comprised of separate DNA fragments containing only the Dx5 and hygromycin resistance (HPTII) genes were introduced separately into Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain for co-infection. Each EHA105 strain harboring Dx5 or HPTII was infected into rice calli at a 3: 1 ratio of EHA105 with Dx5 gene and EHA105 with HPTII gene expressing cassette. Then, among 66 hygromycin-resistant transformants, we obtained two transgenic lines inserted with both the Dx5 and HPTII genes into the rice genome. We reconfirmed integration of the Dx5 and HPTII genes into the rice genome by Southern blot analysis. Wheat Dx5 transcripts in T1 rice seeds were examined with semi-quantitative RT-PCR. Finally, the marker-free plants containing only the Dx5 gene were successfully screened at the T1 generation. These results show that a co-infection system with two expression cassettes could be an efficient strategy to generate marker-free transgenic rice plants.

애기장대에서의 벼 유래의 고친화성 인산 운반체 유전자들의 기능 분석

서현미(Hyounmi Seo),정윤희(Yunhui Jung),김윤혜(Yunhye Kim),권택민(Tackmin Kwon),정순재(Soon-Jae Jeong),이영병(Young-Byung Yi),김도훈(Doh-Hoon Kim),남재성(Jaesung Nam) 한국생명과학회 2008 생명과학회지 Vol.18 No.4

본 연구는 공개된 벼의 유전체 정보를 이용하여서 벼에 존재하는 13 종의 고친화성 인산 운반체 유전자들 중에서 다른 식물 종에서 분리되고 잘 연구된 고친화성 운반체 유전자들과의 아미노산 서열이 유사한 9 종의 OsPT 유전자들(OsPT1, OsPT2, OsPT3, OsPT4, OsPT5, OsPT6, OsPT7, OsPT8, OsPT12)을 그룹1로, 유사성이 낮은 나머지 4종의 OsPT 유전자들(OsPT9, OsPT10, OsPT11, OsPT13)을 그룹2로 세분하였다. 그리고 쌍자엽 모델 식물체인 애기장대를 이용해서 전형적인 고친화성 인산 운반체 유전자 군에 속하는 OsPT1과 OsPT7 유전자의 기능 분석을 시도하였다. OsPT1 유전자를 과발현하는 형질전환체의 생육이 모본에 비교해서 약 30% 증가하는 결과를 보였다. 그러나 발현정도가 낮은 두 종의 형질 전환체들의 생육은 모본과 비슷하였다. 또한 OsPT7 유전자를 과발현하는 형질전환체의 생육도 OsPT7 유전자의 발현량에 비례해서 증가하는 양상을 보였으며 발현이 가장 높은 T-4 line은 생육이 약 2배 증가하였다. 이러한 결과는 단자엽 식물 유래의 OsPT1와 OsPT7 유전자가 쌍자엽 식물체에서도 고친 화성 인산 운반체의 기능을 정상적으로 수행한다는 것을 의미한다. 또한 형질전환체와 모본의 생육 차이에 대한 분자생물학적 해석을 위해서, 애기장대에서 체내 인산 농도 상태를 간접적으로 보여주는 좋은 지시 유전자의 기능을 하는 인산 결핍에 특이적으로 발현하는 유전자인 AtPT1 유전자의 발현량을 조사하였다. OsPT1와 OsPT7 유전자가 과발현하는 형질 전환체에서 인산 결핍에 따른 AtPT1 유전자의 발현이 모본에 비해서 현저히 약하게 유도된다는 결과는 형질전환체가 인산부족에 의한 스트레스가 적다는 것을 간접적으로 보여주는 좋은 증거다. 그 결과로 이들 형질전환체는 모본인 야생형에 비해서 인산 결핍 조건에서도 생육이 좋은 것으로 판단된다. Phosphate, a favorable phosphorous form for plant, is one of major nutrient elements for growth and development in plants. Plants exhibit various physiological and biochemical responses in reaction to phosphate starvation in order to maintain phosphate homeostasis. Of them, expression of high affinity phosphate transporter gene family and efficient uptake of phosphate via them is a major physiological process for adaption to phosphate deficient environment. Although the various genetic resources of high affinity phosphate transporter are identified recently, little is known about their functions in plant that is prerequisite information before applying to crop plants to generate valuable transgenic plants. We demonstrated that Arabidopsis transgenic plants overexpressing two different high affinity phosphate transporter gens, OsPT1 and OsPT7, derived from rice, exhibit better growth responses compared with wild-type under phosphate starvation condition. Specially, OsPT7 gene has proven to be more effective to generate Arabidopsis transgenic plant tolerant to phosphate deficiency than OsPT1. Furthermore, the expression level of AtPT1 gene that is one of reporter genes specifically induced by phosphate starvation was significantly low compared with wild-type during phosphate starvation. Taken together, these results collectively suggest that over expression of OsPT1 and OsPT7 genes derived from monocotyledonous plant function efficiently in the dicotyledonous plant, relieving stress response caused by phosphate starvation and leading to better growth rate.

아그로박테리움를 이용한 국내개발 국화품종 ‘무랑루즈’의 형질전환 기술 및 AtSICKLE 유전자를 이용한 엽형 변화 국화 형질전환체 개발

김윤혜(Yun-Hye Kim),박현명(Hyun-Myung Park),정지용(Ji-Yong Jung),권택민(Tackmin Kwon),정순재(Soon-Jae Jeung),이영병(Young-Byung Yi),김경태(Gyung-Tae Kim),남재성(Jaesung Nam) 한국원예학회 2010 원예과학기술지 Vol.28 No.3

본 연구는 경남 화훼연구소에서 개발 육성된 스프레이형국화 18 품종들에 대한 재분화율을 각각 조사하고, 그 중에서 ‘무랑루즈’가 가장 우수한 재분화 능력이 있음을 확인하였다. 특히 BA(0.5㎎ · L?¹)와 NAA(1.0㎎ · L?¹)를 함유한 MS배지를 신초재분화 배지로 이용함으로써 스탠다드형 국화인 신마와 함께 스프레이형 국화인 ‘무랑루즈’의 잎 절편체부터 효율적으로 신초 형성을 유도하고 완전한 식물체로 재분화시킬 수 있었다. 이러한 신초재분화 조건에서 ‘무랑루즈’잎 절편에 아그로박테리움을 감염하고 10일 동안 함께 배양한 후에, 선발항생제 kanamycin 농도를 저농도(10㎎ · L?¹)에서 고농도(30㎎ · L?¹)로 단계적으로 선발과정을 강화함으로써 효율적인 국화 형질전환체 제작이 가능하였다. 조사한 kanamycin 저항성 식물체 모두에서 전이유전자 AtSICKLE가 존재함을 genomic PCR 방법으로 확인하였다. 비록, 국화에서 그 기능이 비효율적인 CaMV 35S 프로모터를 사용했기 때문에 RT-PCR로 확인한 형질전환체에서의 전이유전자 AtSICKLE의 발현율은 상대적으로 낮았으나, 그 발현이 상대적으로 높은 개체에선 잎의 상편생장에 의한 엽형의 변화가 나타났다. 이러한 연구의 결과는 모델 식물체에서 분리되고 연구된 많은 유전자들이 가지는 화훼작물의 분자육종학적 가치를 국화에서 대량으로 조사할 수 있는 기반을 제공 할 것으로 기대된다. ‘Moulinrouge’ was selected as the best regenerating cultivar among 18 different spray-type chrysanthemum cultivars bred in the Gyeongnam Flowers Breeding Research Institute. When the leaf explants from standard- and spray-type chrysanthemum ‘Jinba’ and ‘Moulinrouge’ were incubated on MS basal medium supplemented with 0.5 ㎎ · L?¹ BA and 1.0 ㎎ · L?¹ NAA, both ‘Jinba’ and ‘Moulinrouge’ induced adventitious shoots that can be regenerated into plantlets. Based on these regeneration conditions, we developed an efficient Agrobacterium-mediated chrysanthemum ‘Moulinrouge’ transformation method by using sequential selection of shoots from low (10 ㎎ · L?¹) to high (30 ㎎ · L?¹) concentrations of kanamycin after co-cultivation of leaf explants with Agrobacterium for 10 days and induction of shoots. All kanamycin resistant plants investigated with genomic PCR analysis carried the report gene, AtSICKLE, in their genome. Although expression levels of the report gene in the transgenic plants investigated with RT-PCR were relatively low because of inefficiency of CaMV 35S promoter in chrysanthemum, transgenic lines expressing AtSICKLE efficiently showed leaf epinasty phenotype. We expect that our results will provide a useful method that can perform a high-throughput investigation of genes isolated and studied well in model plants for molecular breeding of chrysanthemum.

벼 키다리병 저항성 유전자원 탐색

허연재(Yeon-Jae Hur),이샛별(Sais-Beul Lee),신동진(Dongjin Shin),김태헌(Tae-Heon Kim),조준현(Jun-Hyeon Cho),한상익(Sang-Ik Han),오성환(Seong-Hwan Oh),이지윤(Ji-Yoon Lee),손영보(Young-Bo Son),이종희(Jong-Hee Lee),권택민(Tackmin Kwon),박 한국육종학회 2016 한국육종학회지 Vol.48 No.1

Bakanae (foolish seedling) disease caused by Gibberella fujikuroi creates serious problems in the foremost rice growing countries. This study was conducted to identify new resistance genetic sources to Bakanae disease. Bioassay showed that 11 varieties including Gwangmyeongbyeo, Hawn, Wonseadaesoo, Erguailai etc. were resistant to bakanae disease among 254 rice germplasm. Mismatch ratio between phenotype on bakanae disease bioassay and allele type of RM9, a SSR marker closely linked the bakanae disease resistant QTL, qBK1, were 38.3%. These results suggest that RM9 might be used for selecting qBK1, but it cannot be used for wide range of rice germplasm. Resistant germplasm in this study might be have resistant genes different from qBK1. The eleven varieties resistant to selected in this study will be used to identify new resistant alleles or genes to improve bakanae disease resistance in rice.