Cooperative stimulation of cisplatin-mediated apoptosis by hepatitis B virus X Protein and hepatitis C virus core Protein

권현진,장경립,Kwun, Hyun-Jin,Jang, Kyung-Lib Korean Society of Life Science 2007 생명과학회지 Vol.17 No.6

The co-infection with hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C Virus (HCV) is associated with a more severe liver disease and increased frequency in the development of hepatocellular carcinoma com-pared to those with single infection. Here, we demonstrated that HBV X protein (HBx) and HCV Core cooperatively up-regulated the level of p53 in human hepatoma HepG2 cells. The elevated p53 subsequently stimulated the expression of proapoptotic Bax whereas it repressed the expression of antiapoptotic Bcl2. These effects, however, were not observed in p53-negative Hep3B cells. Consistently to their cooperative regulation of apoptotic effectors, HBx and HCV Core additively stimulated cisplatin-mediated apoptotic cell death of HepG2 but not of Hep3B cells. These results may help to explain the development of a more severe liver disease in patients co-infection with HBV and HCV as well as some contradictory results on the roles of HBx and Core in apoptosis. B형 간염 바이러스(HBV)와 C형 간염 바이러스(HCV)에 함께 감염되면 단독 감염의 경우보다 더 심각한 간질환이 유발되고 간암으로의 발전 가능성도 높아진다. 본 연구에서는 HBV의 X단백질(HBx)과 HCV의 코어 단백질이 인간 간암세포주인 HepG2세포에서 p53의 양을 협조적으로 증가시킨다는 것을 보여 주었다. 이로 인하여 세포예정사를 촉진하는 Bax 단백질의 발현이 더 증가하는 반면에 세포예정사를 억제하는 Bcl2의 발현은 더 억제됨이 관찰되었다. 그러나 이러한 효과들은 p53-음성인 Hep3B 세포에서는 관찰되지 않았다. 나아가 HBx와 코어 단백질은 HepG2의 cisplatin-매개성 세포예정사를 협조적으로 증가시키는 반면에 Hep3B에서는 이러한 효과가 나타나지 않았다. 이러한 연구 결과들은 HBV와 HCV가 동시에 감염되었을 경우에 나타나는 임상적인 소견을 이해하고 세포예정사에 미치는 HBx와 코어 단백질의 영향에 대한 기존의 상충적인 연구결과들을 해석하는데 도움을 줄 수 있다.

E. coli 발현 시스템에 의해 생산된 recombinant human bone morphogenetic protein-2의 정제와 생물학적 활성

최경희,문금옥,김수홍,윤정호,장경립,조규성,Choi, Kyung-Hee,Moon, Keumok,Kim, Soo-Hong,Yun, Jeong-Ho,Jang, Kyung-Lib,Cho, Kyoo-Sung 대한치주과학회 2008 Journal of Periodontal & Implant Science Vol.38 No.1

Purpose: Bone morphogenetic protein-2(BMP-2) has been shown to possess significant osteoinducitve potential. There have been attempts to overcome a limitation of mass production, and economical efficiency of BMP. The aim of this study was to produce recombinant human BMP-2(rhBMP-2) from E. coli in a large scale and evaluate its biological activity. Materials and Methods: The E.coli strain BL21(DE3) was used as a host for rhBMP-2 production. Dimerized rhBMP-2 was purified by affinity chromatography using Heparin column. To determine the physicochemical properties of the rhBMP-2 expressed in E. coli, we examined the HPLC profile and performed Western blot analysis. The effect of the purified rhBMP-2 dimer on osteoblast differentiation was examined by alkaline phosphatase (ALP) activity and representing morphological change using C2C12 cell. Results: E. coli was genetically engineered to produce rhBMP-2 in a non-active aggregated form. We have established a method which involves refolding and purifying a folded rhBMP-2 dimer from non-active aggregates. The purified rhBMP-2 homodimer was characterized by SDS-PAGE as molecular weight of about 28kDa and eluted at 34% acetonitrile, 13.27 min(retention time) in the HPLC profile and detected at Western blot. The purified rhBMP-2 dimer stimulated ALP activity and induced the transformation from myogenic differentiation to osteogenic differentiation. Conclusion: rhBMP-2 was produced in E. coli using genetic engineering. The purified rhBMP-2 dimer stimulated ALP activity and induced the osteogenic differentiation of C2C12 cells.

Hepatitis C Virus Core Protein Activates p53 to Inhibit E6-associated Protein Expression via Promoter Hypermethylation

Juri Kwak(곽주리),Kyung Lib Jang(장경립) 한국생명과학회 2018 생명과학회지 Vol.28 No.9

E6AP (E6-associated protein)는 C형 간염바이러스(hepatitis C virus, HCV)의 코어 단백질 유비퀴틴화와 프로테오좀 분해를 유도하여 캡시드 조립을 저해함으로써 HCV 복제를 억제하는 것으로 알려져 있다. 반면에 HCV코어 단백질은 숙주의 항바이러스 방어계에 대항하고 자신의 유비퀴틴-의존적 프로테아좀 분해를 막기 위하여 DNA 메틸화를 통하여 E6AP 발현을 저해하는 전략을 진화과정에서 획득하였다. 본 연구에서는 HCV 코어 단백질이 E6AP 발현을 저해하는 기전을 밝혀내고자 하였다. HCV 코어 단백질은 HepG2 세포에서 DNA 메틸화 효소들인 DNMT1, 3a 및 3b의 단백질 수준과 효소 활성을 증가시켜 프로모터 과메틸화를 통하여 E6AP 발현을 저해하였지만 p53를 발현하지 않는 Hep3B 세포에서는 이러한 효과들이 관찰되지 않았다. 흥미롭게도 Hep3B 세포에 p53만 과발현시키면 HCV 코어 단백질이 없더라도 DNMT가 활성화되고 프로모터 과메틸화를 통하여 E6AP 발현이 저해되었다. 또한 p53 녹다운 및 과발현 실험을 통하여 p53 활성화가 HCV 코어 단백질의 효과에 필수적임을 알 수 있었다. 이로 인하여 Hep3B 보다 HepG2 세포에서 낮은 수준의 유비퀴틴화된 HCV 코어 단백질이 검출되었다. 따라서 HCV 코어 단백질은 p53-의존적으로 자신의 유비퀴틴-매개성 프로테아좀 분해를 저해한다. The E6-associated protein (E6AP) is known to induce the ubiquitination and proteasomal degradation of HCV core protein and thereby directly impair capsid assembly, resulting in a decline in HCV replication. To counteract this anti-viral host defense system, HCV core protein has evolved a strategy to inhibit E6AP expression via DNA methylation. In the present study, we further explored the mechanism by which HCV core protein inhibits E6AP expression. HCV core protein upregulated both the protein levels and enzyme activities of DNA methyltransferase 1 (DNMT1), DNMT3a, and DNMT3b to inhibit E6AP expression via promoter hypermethylation in HepG2 cells but not in Hep3B cells, which do not express p53. Interestingly, p53 overexpression alone in Hep3B cells was sufficient to activate DNMTs in the absence of HCV core protein and thereby inhibit E6AP expression via promoter hypermethylation. In addition, upregulation of p53 was absolutely required for the HCV core protein to inhibit E6AP expression via promoter hypermethylation, as evidenced by both p53 knockdown and ectopic expression experiments. Accordingly, levels of the ubiquitinated forms of HCV core protein were lower in HepG2 cells than in Hep3B cells. Based on these observations, we conclude that HCV core protein evades ubiquitin-dependent proteasomal degradation in a p53-dependent manner.

5'-UTR 영역의 그룹특이적 염기서열에 의한 HGV의 계통분석

김부경,박성우,김종경,백형석,장경립,Kim, Pu-Kyung,Park, Sung-Woo,Kim, Chong-Kyung,Baik, Hyung-Suk,Jang, Kyung-Lib 한국생명과학회 1998 생명과학회지 Vol.8 No.3

한국인 환자의 혈청에서 분리한 HGV 5'-UTR영역의 염기서열을 결정하였다. 이들 염기서열을 이미 보고된 서열들과 비교한 결과, 한국 분리주들은 일본 분리주들과 더 높은 상동성을 나타내어 지리적 격리에 의해 HGV의 염기서열의 변이가 축적되었음을 알 수 있다. 흥미롭게도 동일 지역에서 분리된 HGV 분리주들 간에는 고도로 보존되어 있어 HGV의 분류에 이용가능한 세 개의 영역이 5'-UTR에서 발견되었다. 이들 그룹-특이적 영역에 기초하여, 24 HGV 분리주들을 5개의 그룹으로 분류할 수 있었다. The nucleotide sequences of the 5'-untraslated region(5'-UTR) of Hepatitis G virus(HGV) from sera of Korean patients were determines. When compared to the previously reported isolates, the Korean isolates have higher sequence homology with the Japanese isolates indicating the geographic distribution of HGV variants. Interestingly, three discrete regions which are highly conserved among HGV isolates from the same geographical area, thus could be applied to distinguish HGV isolates from the different areas were noticed in the 5'-UTR. Based on the sequences of these group-specific regions, twenty four different HGV isolates could be classified into 5 groups. By using the group-specific regions, inconsistency in HGV typing when based on the different regions of HGV could be solved.

Sodium Butyrate Alters Cell-Cell Interactions through Up-Regulation of E-Cadherin in Human Hepatocellular Carcinoma Cells

Hyun Jin Kwun(권현진),Kyung Lib Jang(장경립) 한국생명과학회 2009 생명과학회지 Vol.19 No.6

Sodium butyrate (NaBt)는 장에서 탄수화물대사로부터 생겨나는 짧은 천연지방산 사슬로 다양한 인간 암세포들에게서 강력한 항암효능을 나타냄이 보고된 바 있지만 자세한 기전은 아직 알려져 있지 않다. 이 논문에서 우리는 NaBt가 주요 세포부착분자이면서 종양억제인자의 일종인 E-cadherin의 발현을 세포-특이적으로 촉진하는 기전을 연구하였다. 또한 NaBt는 E-cadherin의 발현을 촉진하는 것으로 알려진 p21의 발현도 증가시켰지만, NaBt에 의하여 증가한 p21은 E-cadherin의 활성화와 관련이 없음이 밝혀졌다. 그 대신에 NaBt는 CCAAT-box를 통한 E-cadherin유전자의 프로모터 활성을 증가시킴으로써 E-cadherin의 발현을 전사수준에서 촉진하는 것 같다. 이렇게 NaBt에 의하여 증가된 E-cadherin은 주로 세포간 접촉면에 위치하면서 Hep3B 세포를 더 분화된 형태로 유도하여 NaBt의 항암활성이 나타나는 것 같다. Sodium butyrate (NaBt), a naturally occurring short chain fatty acid derived from carbohydrate metabolism in the gut, is known to exhibit strong anti-cancer potentials in various human cancer cells; however, its action mechanism is poorly understood. In the present study, we demonstrated that NaBt up-regulates levels of E-cadherin, a key cell adhesion molecule implicated as a tumor suppressor, in a cell type-specific manner. Although levels of p21, a potential activator for E-cadherin expression, were also up-regulated by treatment with NaBt in several types of cells, it does not seem to be associated with the activation of E-cadherin in the NaBt-treated cells. Instead, the data from promoter analysis suggest that NaBt up-regulates expression of E-cadherin at the transcription level by enhancing its promoter strength via a CCAAT-box. The elevated E-cadherin in the presence of NaBt was primarily localized at the cell-cell contacts, converting Hep3B cells into a more differentiated form.

Development of a simple and sensitive method to detect enteric viruses from oysters

정은영,제회복,전홍기,윤재득,지영미,천두성,조해월,장경립,Chung, Eun-Young,Je, Hee-Bok,Jun, Hong-Ki,Yoon, Jae-Deuk,Jee, Young-Mee,Cheon, Doo-Sung,Cho, Hae-Wol,Jang, Kyung-Lib Korean Society of Life Science 2002 생명과학회지 Vol.12 No.1

Development of a rapid method possessing the requisite sensitivity and specificity for virus monitoring is necessary for protection of the shellfish-consuming public. Oysters tissue usually contains virus particles in relatively small concentrations along with various other substances that can interfere with detection steps. Therefore, the critical point concerning the detection of viruses in shellfish tissues resides in the processing of samples. The current study demonstrated the possibility of purifying small amounts of virus particles at the interface of a 10/50% sucrose gradient after a single round of sucrose gradient ultracentrifugation. We could detect HAV and poliovirus simultaneously from oyster tissues by using two different sets of primer. Furthermore, the method showed a high level of virus recovery rate (>95%) as determined by plaque assays of the final samples. Taken the advantages of the simple and sensitive methods, it was possible to detect 2 pfu of HAV in 5 g of oyster digestive tissues within 24h. 굴 소비자의 보호를 위해서는 매우 민감하고 특이적으로 바이러스를 모니터링할 수 있는 신속진단법의 개발이 필수적이다. 굴 조직은 흔히 비교적 소량의 바이러스와 검출단계를 방해할 수 있는 다른 물질들을 함께 함유한다. 따라서 굴으로부터 바이러스의 검출에서 가장 중요한 과정은 시료의 가공단계이다. 본 연구에 의하면 한번의 sucrose 구배 초원심분리에 의하여 10%와 50% 사이에서 소량의 바이러스를 분리할 수 있음을 제시하였다. 우리는 두 종류의 primer 세트를 이용하여 HAV와 poliovirus를 동시에 굴 조직으로부터 검출할 수 있었다. 또한, 이 방법은 높은(>95%) 바이러스 회수율을 나타내었다. 이 방법은 24시간이내에 5 g의 굴조직으로부터 2 pfu의 HAV를 검출할 수 있을 정도로 신속하고 민감한 검사법이다.

부산, 울산 및 경상남도 지역의 지하수 중 norovirus 오염실태 조사

Byung Ju Park(박병주),Hae Ri Oh(오혜리),Ho Young Kang(강호영),Kyung Lib Jang(장경립) 한국생명과학회 2011 생명과학회지 Vol.21 No.6

본 연구에서는 2009년부터 2010년까지 부산, 경남 및 울산 지역의 145 개 지하수 시료들을 대상으로 norovirus의 오염실태를 조사하였다. 먼저 norovirus의 검출을 위한 두 세트의 primer를 제작하였으며 이를 이용하여 최적 nested reverse transcription (RT)-PCR 조건을 확립하였다. 지하수의 norovirus 오염실태 조사에 의하면, 건기(4월~6월)와 우기(7월~8월)에 각각 21개(25.9%)와 15개(23.4%)의 시료에서 norovirus가 검출되었다. 부산, 울산 및 경상남도의 시료에서 각각 15%, 7% 및 32%의 norovirus가 검출되어 지역적인 차이를 나타내었다. norovirus 양성시료에서 GI과 GII가 각각 5개와 31개가 검출되어GI에 비하여 GII가 우세함을 알 수 있었다. norovirus 분리주들의 계통분류학적 분석 결과에 의하면, GI 분리주들은 모두 GI.5 유전자형으로 분류되었으며, GII 분리주들은 GII.3과 GII.4로 양분되었다. norovirus의 검출은 pH, 온도, 산화-환원전위 및 용존산소 등의 이화학적 인자들과 일반세균, 총대장균군 및 대장균과 같은 미생물 수질지표들과 통계적인 유의성이 있는 상관관계를 나타내지 않았다. 반면에 norovirus의 검출과 저탁도(<0.50 NTU) 사이에는 밀접한 상관성이 있음이 밝혀졌다. 본 연구를 통하여 지하수 중 norovirus의 분포실태를 어느 정도 파악할 수 있었으며 수인성 질병의 예방과 국민 보건위생을 위해서는 지하수의 주기적인 norovirus 모니터링이 필요함을 제시하였다. To inspect norovirus contamination of groundwater in south eastern areas of Korea, a systematic survey of groundwater in Busan, Ulsan, and Gyeongsangnam-do was performed for two years from 2009 to 2010. For this purpose, we first optimized the nested reverse transcription-PCR condition by designing two sets of primers for the detection of norovirus genogroups, GI and GII. Of 145 samples, 21 (25.9%) and 15 (23.4%) were norovirus positive in the dry season (April to June) and wet season (July to August), respectively. The detection frequencies of norovirus in Busan, Ulsan, and Gyeongsangnam-do were 15%, 7%, and 32%, respectively, reflecting a geographical difference in their distribution. The GI and GII isolates were 5 and 31, respectively, indicating the prevalence of GII in the tested areas. According to phylogenetic analysis of their nucleotide sequences, all of the GI isolates were identified to genotype GI.5 whilst the GII isolates were divided into two genotypes, GII.3 and GII.4. Neither physical-chemical parameters such as pH, temperature, oxidation-reduction potential, and dissolved oxygen, nor microbial indicators of water quality such as total bacteria, total coliforms, and Escherichia coli were statistically correlated with contamination of norovirus in the groundwater. Interestingly, however, the presence of norovirus was closely correlated with low turbidity (<0.50 NTU). The present study suggests that periodical monitoring of norovirus in groundwater is necessary to prevent epidemic waterborne diseases and to secure better sanitary conditions for public health.

응집제 생산 미생물의 분리 및 배양조건

남진식(Jin-Sick Nam),권기석(Gi-Seok Kwon),황지숙(Ji-Sook Hwang),이문호(Mun-Ho Lee),장경립(Kyung-Lib Jang),윤병대(Byung-Dae Yoon),이태호(Tae-Ho Lee) 한국생물공학회 1995 KSBB Journal Vol.10 No.4

Acinetobacter sp. BE-254에 의한 유화제의 생산

최경숙,장경립,임이종,김순한,정영기,이태호 동의대학교 기초과학연구소 1997 基礎科學硏究論文集 Vol.7 No.1

The strain producing bioemulsifier was isolated from soil samples. The isolated strain was identified as the genus Acinetobacter through its morphological, cultural and physiological characteristics. The highest emulsification activity and stability by Acinetobacter sp. BE-254 was observed after 5 days of cultivation in the culture medium containing n-hexadecane 4%, NaNO₃0.2%, KH₂PO₄0.01%, MgSO₄·7H₂O 0.01%, CaCl₂0.01%, and yeast extract 0.01%. The optimum pH and temperature for bioemulsifier production were pH 7.0 and 30℃, respectively. Furthermore the most of bioemulsifier was produced during the exponential growth phase, and this suggested that the bioemulsifier production was growth-associated. The bioemulsifier showed good emulsification activity on various emulsifying substrates such as hydrocarbons, edible oils, and petroleum fractions.

2-O-α-D-Glucopyranosyl L-Ascorbic acid 생산을 위한 Cyclodextrin glucanotransferase의 고정화

성경혜,김성구,장경립,전홍기 부산대학교 김치연구소 2003 김치의 과학과 기술 Vol.9 No.-

AA를 AA-2G로 전환하는 CGTase를 고정화하여 AA-2G 대량 생산의 가능성을 고찰한 결과, CNBr-sepharose 4B가 가장 효과적인 담체로 판명되었고, CGTase의 고정화 최적 조건과 고정화 CGTase에 의한 AA-2G 생산의 최적조건 및 재사용성을 검토하였다. 최적 고정화 조건은 효소량 24,000 units/g resin으로 9시간 반응하여 약 18,000 units/g resin의 최고 고정화율을 얻을 수 있으며, pH 5.0(50 mM sodium citrate buffer)용액에 12% AA-Na와 8% soluble starch를 기질로 하여 800 units/ml의 고정화 CGTase를 첨가한 후 37℃에서 100 rpm으로 교반하면서 25시간 반응하여 약 18 mM의 AA-2G 최고량을 얻을 수 있었다. 또한 0.015 mM의 CaCl₂를 첨가하여 고정화 CGTase의 재사용성을 관찰한 결과, 5회까지 50% 이상의 AA-2G 생산율로서 그 가능성을 입증할 수 있었다. 그리고 효소의 재사용성이란 측면에서, 본 고정화의 다른 한 방법인 ultrafiltration(한외 여과)에 의해서는 Millipore사의 YM10 membrane을 이용하여 먼저 단백질량과 효소 활성 변화를 측정하여 그 가능성을 확보할 수 있었으며, 기질 20 ml을 사용하여 AA-2G를 생성시킨 후, 한외여과에 의해 효소만을 회수하여 연속 반응해 본 결과 8회까지 50% 의 생성률을 유지하였다. 따라서 한외 여과는 CNBr-sepharose 4B와 함께 효율적인 고정화의 한 방법으로 판명되었으며, 앞으로 이들 고정화 효소를 이용한 연속 반응 시스템의 구축이 뒤따라야 할 것이다. Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) from Paenibacillus sp. JB-13 was immobilized on various carriers by several immobilization methods such as ionic binding, covalent linkage and ultrafiltration to improve the process performance. The ultrafiltration and covalent linkage with CNBr-activated sepharose 4B were found as the best method for immobilization of CGTase. The ability of was as follows: contact time 6 hrs at 37℃, pH6.0, 100rpm and enzyme loading 24,000 units/g resin. The optimum conditions for production of 2-O-α-D-Glucopyranosyl L-Ascorbic acid by immobilized CGTase turned out to be: pH 5.0, temperature 37℃. 20% substrate solution containing 8%(w/v) of soluble starch and 12%(w/v) of L-ascorbic acid sodium salt, 100 rpm, for 25 hrs and with 800 units of immobilized CGTase/ml substrate solution. More over the CGTase activity could be stably maintained for 8 times of repetitive reactions after removing products by ultrafiltration through YM 10 membrane.