Purification and Characterzation of a Restriction Endonuclease from Pseudomonas syringae pv.phaselicola

배무,이은영,Bae, Moo,Lee, Eun-Young The Korean Society for Microbiology and Biotechnol 1994 한국미생물·생명공학회지 Vol.22 No.5

A restriction endonuclease, PsyI, has been isolated from Pseudomonas syringae pv. pha- seolicola, and its catalytic properties have been studied. This enzyme was purified through strepto- mycin sulfate and ammonium sulfate fractionation, phosphocellulose Pll, DEAE-cellulose, hydroxy- apatite and Sephadex G-100 column chromatography. It's molecular weight was about 50,000 dalton as determined by 7.5% polyacrylamide gel electrophoresis containing 0.1% SDS. In catalytic proper- ties, PsyI shows stable at wide ranges of pH between 7.0 and 10.0, of temperature between 30$\circ$C and 37$\circ$C, and its thermal stability is between 25$\circ$C, and 45$\circ$C, at the presence Of 10 mM MgCl$_{2}$-PsyI essentially require Na salt for enzyme reaction, is rather inhibited in the high Na salt concent- ration. The presence of 2-mercaptoethanol is absolutely required for the enzyme activity. This endonuclease, PsyI was determined to be an isoschizomer of SalI from the results of the restriction mapping and DNA sequencing.

지렁이 분변토로부터 황화수소 분해 균주의 분리 및 특성

이은영,조경숙,류희욱,박상진,배무 ( Eun Young Lee,Kyung Suk Cho,Hee Wook Ryu,Sang Jin Park,Moo Bae ) 한국환경생물학회 1997 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.15 No.1

A new sulfur -oxidizing bacterium which was capable of degrading hydrogen sulfide was isolated from earthworm casts using deodorant materials. The cell of isolate CP-5 was short rod, gram negative and non-motile, the activities of cytochrome oxidase and catalase were positive. The isolate could autotrophically grow in the basal mineral medium supplemented the reduced sulfur compounds such as thiosulfate and elemental sulfur. This bacterium could oxidize thiosulfate and elemental sulfur to sulfate, and the metabolic intermediates were considered as tetrathionate and thiosulfate, respectively. The removal of hydrogen sulfide by the isolate CP-5 was confirmed, and the CP-5 was regarded as one of microorganisms responsible for degradation of hydrogen sulfide in earthworm casts. The isolate CP-5 can be applied to biodeodorization systems for the improvement of removal efficiency of hydrogen sulfide.

미생물 일반 , 생리 및 대사 점토로부터 철불순물의 생물학적 제거에 미치는 탄소원의 영향

이은영,조경숙,류희욱,배무 ( Eun Young Lee,Kyung Suk Cho,Hee Wook Ryu,Moo Bae ) 한국미생물생명공학회 1997 한국미생물·생명공학회지 Vol.25 No.6

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola로부터 제한효소의 분리정제 및 특성

배무,이은영 이화여자대학교 생명과학연구소 1994 생명과학연구논문집 Vol.5 No.-

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola로 부터 새로운 제한효소 Psy1을 분리하여 그 촉매적 특성에 관하여 조사하였다. 효소의 정체를 위하여 70g의 균체를 이용하였고, 300watt에서 6분간(2분간 3번씩) 열을 위헤서 초음파 마쇄하였다. 이것을 streptomycin sulfate 침전, ammonium sulfate 침전, phosphocellulose pll, DEAE-cellulose, hydroxyapatite, Sephadex G-100 column chromatography를 통해 정제하여 순수한 단백질을 얻었다. 그 단백실 subunit의 분자량은 0.1%의 SDS를 포함하는 polyacrylamide gel에서 전기 영동한 결과를 토대로 분석한 결과 약 50,000 dalton으로 추정된다. 이 효소의 촉매적 성질은 pH7에서 pH10 사이의 광범위한 pH 영역에서 안정하였고, 적정반응온도는 30℃에서 37℃였으며, 그 온도 안정성은 25℃에서 45℃ 사이로 나타났다. 이 효소는 20mM 이상의 MgCl_2, 25mM 이상의 NaCl에서 활성이 저해되었으며, 2-mercaptoethanol 400mM까지 첨가시 계속 활성을 보였고, 플라스미드인 pBR 322와 pUC 18, 그리고 pBS등을 절단할 수 있었다. Lamda DNA를 여러 종류의 제한효소로 절단하여 제한효소 지도를 작성한 결과 SalI의 isoschizomer로 확인되었고 염기서열의 조사 결과로도 확인하였다. A restriction endonuclease, PsyI, has been isolated from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, and its catalytic properties have been studied. This enzyme was purified through streptomycin sulfate and ammonium sulfate fractionation, phosphocellulose pll, DEAE-cellulose, hydroxyapatite and Sephadex G-100 column chromatography. It's molecular weight was about 50,000 dalton as determined by 7.5% polyacrylamide gel electrophoresis containing 0.1% SDS. In catalytic properties, PsyI shows stable at wide ranges of pH between 7.0 and 10.0 of temperature between 30℃ and 37℃, and its thermal stability is between 25℃ and 45℃ at the presence of 10 mM MgCl_2 PsyI essentially require Na salt for enzyme reaction, is rather inhibited in the high Na salt concentration. The presence of 2-mercaptoethanol is absolutely required for the enzyme activity. This endonuclease, PsyI was determined to be an isoschizomer of SalI from the results of the restriction mapping and DNA sequencing.

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola로부터 제한효소의 분리정제 및 특성

배무,이은영 한국산업미생물학회 1994 한국미생물·생명공학회지 Vol.22 No.5

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola로부터 새로운 제한효소 PsyI을 분리하여 그 촉매적 특성에 관하여 조사하였다. 효소의 정제를 위하여 70 g의 균체를 이용하였고, 300watt에서 6분간(2분간 3번씩) 얼음 위에서 초음파 마쇄하였다. 이것을 streptomycin sulfate 침전, ammonium sulfate 침전, phosphocellulose pll, DEAE-cellulose, hydroxyapatite, Sephadex G-100 column chromatography를 통해 정제하여 순수한 단백질을 얻었다. 그 단백질 subunit의 분자량은 0.1%의 SDS를 포함하는 polyacrylamide gel에서 전기 영동한 결과를 토대로 분석한 결과 약 50,000 dalton으로 추정된다. 이 효소의 촉매적 성질은 pH7에서 pH10 사이의 광범위한 pH 영역에서 안정하였고, 적정반응온도는 30℃에서 37℃였으며, 그 온도 안전성은 25℃에서 45℃ 사이로 나타났다. 이 효소는 20mM 이상의 MgCl_2, 25mM 이상의 NaCl에서 활성이 저해되었어며, 2-mercaptoethanol 400mM까지 첨가시 계속 활성을 보였고, 플라스미드인 pBR 322와 pUC 18, 그리고 pBS 등을 절단할 수 있었다. Lamda DNA를 여러 종류의 제한효소로 절단하여 제한효소 지도를 작성한 결과 SalI의 isoschizomer로 확인되었고 염기서열의 조사 결과로도 확인하였다. A restriction endonuclease, PsyI, has been isolated from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, and its catalytic properties have been studied. This enzyme was purified through streptomycin sulfate and ammonium sulfate fractionation, phosphocellulose P11, DEAE-cellulose, hydroxyapatite and Sephadex G-100 column chromatography. It's molecular weight was about 50,000 dalton as determined by 7.5% polyacrylamide gel electrophoresis containing 0.1% SDS. In catalytic properties, PsyI shows stable at wide ranges of pH between 7.0 and 10.0, of temperature between 30℃ and 37℃, and its thermal stability is between 25℃ and 45℃ at the presence of 10 mM MgCl_2. PsyI essentially require Na salt for enzyme reaction, is rather inhibited in the high Na salt concentration. The presence of 2-mercaptoethanol is absolutely required for the enzyme activity. This endonuclease, PsyI was determined to be an isoschizomer of SalI from the results of the restriction mapping and DNA sequencing.

지렁이 분변토로부터 황화수소 분해 균주의 분리 및 특성

배무,박상진,류희욱,조경숙,이은영 이화여자대학교 환경문제연구소 1997 이화환경연구 Vol.1 No.-

탈취제로 이용되고 있는 지렁이 분변토로 부터 황화수소를 제거하는 황산화 세균 CP-5를 분리하였다. 이 균주는 운동성이 없고 Gram 음성인 단간균 이었으며, cytochrome oxidase와 catalase test에 양성 반응을 보였다. CP-5 균주는 환원형 황합물을 기질로 하는 배지에서 독립영양적인 생장이 가능하였다. 이 균주는 thiosulfate 에서 tetrathionate를 중간생성물로 하여 최종적으로 sulfate로 산화하고, elemental sulfur를 일단 thiosulfate로 산화한 후, sulfate까지 재산화하는 것으로 사료되었다. 독립영양 배지에 yeast extract 를 첨가하면 균의 생장이 촉진되었다. CP-5 균주 현탁액에 H₂S를 2vvm의 유속으로 주입하면 140ppm까지는 거의 완전하게 제거 가능하였다. 본 연구결과로부터 CP-5 균주는 분변토에서 황화수소를 제거하는 대표적인 탈취균주이며, 황화수소 제거를 위한 생물학적 탈취 공정에 활용 가능하다는 것을 알 수 있었다. A new sulfur-oxidizing bacterium which was capable of degrading hydrogen sulfide was isolated from earthworm casts using deodorant materials. The cell of isolate CP-5 was short rod, gram negative and non-motile, the activities of cytochrome oxidase and catalase were positive. The isolate could autotrophically grow in the basal mineral medium supplemented the reduced sulfur compounds such as thiosulfate and elemental sulfur. This bacterium could oxidize thiosulfate and elemental sulfur to sulfate, and the metabolic intermediates were considered as tetrathionate and thiosulfate, respectively. The removal of hydrogen sulfide by the isolate CP-5 was confirmed, and the CP-5 was regarded as one of microorganisms responsible for degradation of hydrogen sulfide in earthworm casts. The isolate CP-5 can be applied to biodeodorization systems for the improvement of removal efficiency of hydrogen sulfide.

점토로부터 철불순물의 생물학적 제거에 미치는 탄소원의 영향

류희욱,배무,조경숙,이은영 이화여자대학교 환경문제연구소 1997 이화환경연구 Vol.1 No.-

적색의 점토로부터 철불순물을 제거하여 양질의 백색 점토를 얻기 위하여 철환원 미생물을 이용하여 생물학적 철제거 효율에 미치는 탄소원의 영향을 조사하였다. 탄소원으로 단당류인 glucose와 이당류인 maltose와 sucrose를 1∼5%(w/w) 농도로 첨가하여 철환원 효율을 조사한 결과, 탄소원의 첨가량이 증가할수록 철제거율도 증가하였다. 각 탄소원을 5% 첨가했을 때 최대 44.2∼45.4%의 철을 제거할 수 있었다. 점토로부터 탄소원으로 당류를 산화하여 주로 발효대사산물을 생성하는 발효 철환원 세균 두 종을 분리하였으며, Bacillus sp. 와 Pseudomonas sp. 로 동정되었다. 철환원 미생물에 의한 점토의 철제거 처리에 의해 점토의 백색도는 63.20에서 79.64로 증가하였으며 적색도는 13.47에서 3.55로 감소하여 저질의 점토가 양질의 점토로 개량이 가능하였다. 또한, 에너지 분산 분석법에 의해 점토내의 주요 광물의 조성비를 조사한 결과, 철환원 미생물은 점토 광물의 조성비에는 거의 영향을 미치지 않고, 선택적으로 철불순물만을 제거하였음을 알 수 있었다. Korea-Fe(Ⅲ) impurities in clay could be microbially removed by inhabitant dissimilatory Fe(Ⅲ) reducing microorganisms. Insoluble Fe(Ⅲ) in clay particles was leached out as soluble reductive form, Fe(Ⅱ). The microorganisms removed from 10 to 45% of the initial Fe(Ⅲ) when each sugar was supplemented to be in ranges of 1∼5%(w/w; sugar/clay). The microorganisms reduced 2.1∼12.8 mol of Fe(Ⅲ) per 100 mol of carbon in sugars metabolized when sugars such as glucose, maltose, and sucrose were used as sole carbon source. Bacillus sp. IRB-W and Pseudomonas sp. IRB-Y were isolated from the enrichment culture of the clay. The isolates were considered to participate in metabolizing organic compounds to fermentative intermediates with relatively little Fe(Ⅲ) reduction at initial Fe(Ⅲ) reduction process. By the microbial treatment, the whiteness of the clay was increased form 63.20 to 79.64, wherase the redness was obviously decreased form 13.47 to 3.55. This treatment did not cause any unfavorable modifications in mineralogical compositions of the clay.