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인간 난관상피세포의 공배양이 생쥐 초기배아의 체외성장에 미치는 영향
이규섭(Kyu Sup Lee),고형권(Hyeong Gweon Ko),신병섭(Byeong Sub Shin),이영아(Young A Lee),김상우(Sang Woo Kim),나용진(Yong Jin Na) 대한산부인과학회 2000 Obstetrics & Gynecology Science Vol.43 No.6
목적 : 공배양술이 생쥐 초기배아의 발생에 미치는 효과를 조사하고, 공배양을 초기배아의 유전자 활성화 시기인 1-세포기 배아 전후에 적용하여 공배양의 시작시기와 기간이 배아발달에 미치는 효과를 알아보고자 하였다. 연구방법: 과배란 유도 후 얻은 ICR 계통의 생쥐 1-세포기 배아를 인간 난관상피세포와 96시간동안 CO2 배양기(37 ℃, 5 % CO2)에서 공배양하였으며, 대조군으로 1-세포기 배아를 0.4 % BSA를 함유한 HTF 배양액에서 단독배양하였다(실험 1). 생쥐 1-세포기 배아를 인간 난관상피세포와 공배양 후 hCG 주사시간을 기준으로 36, 44, 52, 60시간째 각각 0.4 % BSA를 함유한 HTF 배양액으로 옮겨 계속 배양하였으며(실험 2), 반대로 생쥐 1-세포기 배아를 0.4 % BSA를 함유한 HTF 배양액으로 먼저 배양한 후 hCG 주사시간을 기준으로 36, 44, 52, 60시간째 각각 난관상피세포와 공배양하였다(실험 3). 배양 24, 48, 72, 96, 120, 144시간 후에 각 배아의 난할 정도를 관찰하여 2-세포기, 4∼8 세포기, 상실배 및 포배 등으로 분류하였다. 결과 : 실험 1에서 2-세포기로 발생한 경우는 공배양군과 배양액 단독군간에 유의한 차이는 없었다(p>0.05). 그렇지만 4-세포기 이후의 발달율은 공배양군에서 배양액 단독군에 비해 통계적으로 유의하게 높았다(p<0.05). 실험 2에서 4-세포기 이후의 배아발달율은 공배양의 처리시기에 따라 유의한 차이를 보였는데 hCG 주사 후 60시간군에서 포배까지의 배아발달율은 포배까지 계속 공배양을 한 군과 유의한 차이가 없는 반면, hCG 주사 후 60시간 이전에 공배양의 효과를 제거한 나머지 3개군은 포배기배아 발달율이 유의하게 감소하였다(p<0.05). 실험 3에서 4-세포기 이후의 배아발달율은 공배양을 초기부터 시작할수록 높았으며, hCG 주사 후 52시간부터 공배양 했을 때 4-세포기 이후 포배까지의 배아발달율은 지속적으로 공배양을 한 군에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05). 결론 : 배아의 발달율을 높이기 위해서는 초기부터 공배양을 시작하는 것이 좋으며, 특히 배아의 2차 핵분열이 일어나는 기간동안 공배양 환경을 지속시켜 주어야만 공배양에 의하여 2-cell block을 극복하여 포배이후까지의 배아발달에 도달할 수 있을 것으로 사료된다. Objective: To examine the effects of coculture with human oviductal cells regarding the development of 1-cell stage ICR mouse embryos and to investigate the effects of duration and start time of coculture. Materials and Methods: ICR mice were superovulated with PMSG/hCG and 1-cell stage mouse embryos were recruited. 1-cell mouse embryos were cocultured on human oviductal cells in a CO2 incubator(coculture group) and were cultured on 0.4 % BSA+HTF media(control group)(Experiment 1). 1-cell mouse embryos were cocultured on human oviductal cells for 36, 44, 52, 60 hours after hCG IP respectively, and then were transferred to 0.4 % BSA+HTF media(Experiment 2). In comparison, 1-cell mouse embryos were cultured by using 0.4 % BSA+HTF media, and then were transferred to human oviductal cell coculture system using the same schedule(Experiment 3). Afterward, they were examined regarding the development to 2-cell, 4∼8 cell stage mouse embryos, morulas and blastocysts. Results: In experiment 1, the developmental rates to 2-cell embryos of coculture group and control group were 97.3 % and 98.7 %, respectively. After 2-cell embryos, coculture group showed significantly higher developmental rate than control group (p<0.05). In experiment 2, the developmental rates after 2-cell embryos showed the significant differences. The groups with coculture effects removed before post-hCG 60 hours showed significantly lower developmental rates (p<0.05). In experiment 3, the developmental rates after 2-cell embryos were higher when the coculture started at an earlier stage. Furthermore, the groups which were cocultured from post-hCG 52 hours exhibited significant lower developmental rate than the groups which were cocultured continuously (p<0.05). Conclusion: The coculture with human oviductal cell could improve the development of the embryos in vitro and might mimic the natural physiological condition better than media environment. The degree of improvement was more pronounced when the coculture started at an earlier stage and the duration of coculture was longer. More importantly, the changes of culture condition at post-hCG 52 hours in which secondary mitosis occurs, have significant detrimental effects on growth and development of mouse embryos.
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