Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for co-production of 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol

고연주 부산대학교 대학원 2017 국내박사

최근 재생가능한 바이오매스를 이용하여 생물학적인 방법으로 유용하고 다양한 화학물질을 생산해내는 기술이 많은 관심을 받고 있다. 특히, 미생물을 이용하여 폐글리세롤로부터 3-hydroxypropionic acid (3-HP)나 1,3-propanediol (1,3-PDO)을 생산해내는 것은 기술적, 경제적, 산업적 측면에서 높은 가치를 가지는 것으로 평가되고 있다. 이에 따라 효과적으로 3-HP 또는 1,3-PDO을 생산할 수 있는 우수한 산업 균주를 개발하는 연구가 많이 진행되어왔다. 그러나 이와 같은 기술을 이용하여 상업적 규모로 대량 생산을 진행하기 위해서 필요한 높은 수율, 높은 생산성, 높은 농도 등의 요구 조건들을 여전히 충족시키지 못하고 있다. 본 연구에서는 글리세롤을 이용할 수 있는 다양한 미생물 중 상용화 가능성이 높은 균주로 알려져 있는 Klebsiella pneumoniae를 이용하였으며, 대사공학기술을 적용하여 3-HP 또는 1,3-PDO를 높은 농도로 생산할 수 있는 재조합 균주를 개발하고자 하였다. 먼저 LPS 생산이 적은 K. pneumoniae J2B 및 K. pneumoniae GSC021을 분리하고, 이를 이용하여 3-HP 및 1,3-PDO의 동시 생산 및 산업 균주로써의 개발 가능성을 조사하였다. 두 균주 모두 높은 수율로 동시생산이 가능하며, 산업적으로 유용한 균주가 될 수 있는 것으로 판단되었다. 비록 차이가 크지는 않지만 동시 생산 수율 및 효소 활성 측면에서 볼 때 K. pneumoniae J2B가 조금 더 우수한 것으로 확인되었다. 이와 같이 우수한 균주로 평가된 K. pneumoniae J2B를 이용하여 3-HP 및 1,3-PDO의 동시 생산에서 부산물의 생산을 줄이는 재조합 균주를 개발하고, 동시생산 수율 및 생산성을 향상시키는 연구를 진행하였다. ethanol, lactate, succinate 생산에 관련된 유전자를 제거하여 부산물 생산을 줄인 결과, acetate/pyruvate가 세포 내에 축적되어 세포 성장 및 동시 생산성을 떨어뜨리는 것을 알 수 있었다. 따라서 acetate의 생산을 줄이기 위해 glycolytic pathway에 관련된 유전자를 제거하거나, reductive pathway에 관련된 유전자들을 과발현하는 전략을 사용하였다. 이와 같은 접근법을 이용하였을 때, acetate의 생산이 약간 줄어들었으나, 여전히 많은 양의 acetate를 생산하는 것으로 확인되었다. 나아가 acetate/pyruvate의 축적을 줄이기 위해 K. pneumoniae에서 TCA 회로에 관련된 효소들의 활성을 증가시키는 연구가 수행되었다. 이를 위해 TCA/glyoxylate shunt의 negative regulator로 알려져 있는 유전자를 제거하거나 anaplerotic pathway를 활성화시키는 유전자를 과발현하는 방법을 사용하였다. 그러나 이와 같은 방법이 K. pneumoniae에서 acetate/pyruvate의 축적을 줄이는데 큰 효과가 없는 것으로 나타났다. 이를 바탕으로 K. pneumoniae에 대한 NADH level 분석 및 electron transport chain (ETC)에 관련된 유전자들의 발현 정도를 조사하였다. 그 결과 낮은 ETC의 활성이 세포 내 NADH level를 증가시켜 TCA 회로의 활성을 저해하는 것으로 판단되었다. 이와 같은 연구는 K. pneumoniae에서 부산물들의 축적을 줄이고 목적으로 하는 생산물을 효과적으로 생산하고자 할 때 유용한 정보가 될 수 있을 것이다.

1,3 Propanediol을 이용하여 제작된 PZT(30/70) 후막의 강유전 및 초전특성에 관한 연구

송금석 仁荷大學校 大學院 2003 국내석사

Pt/TiO_(x)/SiO_(2)/Si 기판 위에 1,3 propanediol 을 이용해 Sol-gel 법으로 제작한 PZT(30/70) 후막의 구조적 및 전기적, 강유전 및 초전특성에 대하여 조사하였다. 열처리 공정은 thermal stress 를 줄이기 위해 RTA 를 사용하였고, 최종적으로 650℃ 의 furnace 에서 annealing 하였다. SEM 분석 결과 1회 코팅에 350nm 의 두께를 얻었으며, 3회 코팅으로 1μm 정도의 두께를 얻었다. C-D 측정결과, 1kHz 에서 비유전률과 유전손실은 각각 886과 0.03이었다. C-V 곡선은 좌우 대칭인 나비모양을 나타내었다. 누설전류밀도는 200 ㎸/㎝ 에서 1.23×10^(-5) A/㎠ 이었으며, 이력곡선으로부터 구한 잔류분극(Pr) 과 항전계(Ec) 는 각각 33.8 μC/㎠와 56.9㎸/㎝ 이었다. 초전특성은 Dynamic 방법을 이용하여 변조 주파수 의존성을 조사하였다. 초전계수는 5.0×10^(-8) C·㎝/J 로 bulk 의 약 3.8×10^(-8) C·㎝/J 보다 우수한 값을 보였다. 전압감도에 대한 재료평가지수는 3.4×10^(-11) C·㎝/J 과 비검출능에 대한 재료평가지수는 5.9×10^(-9) C·㎝/J 를 나타내었다. 초전전압은 10 Hz에서 최대값인 7.6×10 -3 ㎷ 를 나타내었고, 잡음전압은 Johnson 잡음의 영향으로 거의 f^(-1/2) 에 비례하여 증가하였다. 잡음등가전력과 비검출능은 같은 주파수 80 Hz 에서 2.83×10^(-7) W/Hz^(1/2) 과 3.13×10^(5)㎝·Hz^(1/2) /W 의 최소값과 최대값을 나타내었다. 결론적으로 본 연구에서 제작된 PZT(30/70) 후막은 우수한 강유전 및 초전특성을 보였으며, 1,3 propanediol 을 이용한 sol-gel 법은 초전형 적외선센서 제작에 유용할 것으로 사료된다. We have evaluated structural, electric, ferroelectric and pyroelectric properties of PZT(30/70) thick film prepared by using 1,3 propanediol-based sol-gel method on Pt/Ti/SiO_(2)/Si substrates. Rapid thermal annealing(RTA) is used to reduce the thermal stress and final furnace annealing is processed at 650℃. As the results of SEM analysis, we find that the thickness for one coating is 350 nm and that for three times of coating is 1 μm. From the results of C-d analysis at 1 kHz, dielectric constant(εr) and dissipation factor were 886 and 0.03, respectively. C-V curve is shaped as a symmetrical butterfly. Leakage current density at 200 ㎸/㎝ is 1.25×10^(-5) A/㎝ and in the results of the analysis of hysteresis loops measured at 150 ㎸/㎝, the remnant polarization(Pr) and the coercive field(Ec) are 33.8 μC/㎠ and 56.9 ㎸/㎝, respectively. Pyroelectric property is studied with the modulation frequency dependence by the dynamic method system. The pyroelectric coefficient of PZT(30/80) thick film (5.0×10^(-8) C/㎠·J) is higher than that of bulk (3.8×10^(-8) C/㎠· K). Figure of merit Fv for voltage reponsivity is 3.4×10 -4 C·㎝/J, and figure of merit Fd for specific detectivity is 5.9×10^(-9) C·㎝/J. Pyroelectric voltage shows 7.6×10^(-3) ㎷ at 10 Hz and noise voltage is dominated by Johnson noise, which increases nearly proportionally to f^(1/2). Noise equivalent power and specific detectivity are 2.83×10^(-7) W/Hz^(1/2) and 3.13×10^(5) ㎝·Hz^(1/2) /W at the same frequency of 80 Hz, respectively. PZT(30/70) thick film exhibits relatively good ferroelectric and pyroelectric properties, and we are certain that the sol-gel method using 1,3 propanediol is very useful in realizing pyroelectric IR sensor devices.

Production of 1,3-Propanediol from glycerol : Evaluation of Pseudomonas denitrificans as host

권성진 부산대학교 대학원 2017 국내석사

1,3-Propanediol (1,3-PDO)은 카펫의 주원료인 polytrimethylene terephalate (PTT) 같은 산업적 고분자의 단량체, 화장품의 보습제나 식품, 의약, 윤활제 등 다양한 분야에서 생산 원료로 이용되는 중요 화학물질로 1,3-PDO 로부터 생산 가능한 새로운 고분자 상품들이 개발됨에 따라 그 시장이 빠르게 성장하는 추세이다. 현재 이러한 1,3-PDO 의 생산방법으로 지속가능하고 저렴한 바이오매스를 이용하는 생물학적 생산이 활발히 연구되고 있는 가운데 1,3-PDO 를 생산하는 기존 미생물들의 단점을 극복하며 효과적으로 1,3-PDO 를 생산하기 위하여 본 연구에서는 글리세롤로부터 1,3-PDO 를 생산하기 위한 균주로 Pseudomonas denitrificans 를 제안하고 1,3-PDO 생산 균주로서의 개발가능성을 평가하였다. 이를 위하여, glycerol dehydratase (DhaB), glycerol dehydratase reactivase (GdrAB)와 함께 1,3-PDO oxidoreductase 인 NADH-dependent oxidoreductase (DhaT) 또는 NADPH-dependent oxidoreductase (YqhD)를 과발현 시킨 두 가지 다른 재조합 P. denitrificans 균주를 개발하였다. 우선, DhaT 를 과발현한 재조합 균주는 미호기 조건하에서 1,3-PDO 를 성공적으로 생산하였다. 그러나 1,3-PDO 생산과 함께 부산물로 3-hydroxypropionic acid (3-HP)가 생산되었고, 배양시 산소공급량이 증가할수록 3-HP 의 생산이 증가되었다 이러한 결과는 1,3-PDO 생산을 감소시켰다. 이는 3-HP 생산이 세포 내 산화 환원 정도에 영향을 받음을 보여준다. 나아가 본 연구에서는 DhaT 효소의 가역성이 생산된 1,3- PDO 를 다시 3-HPA(3-hydroxypropionaldehyde)로 전환함으로써 3-HP 생산에 영향을 미쳤을 가능성을 조사하였다. 이러한 가정 하에 DhaT 를 YqhD 로 대체하여 DhaT 의 가역성이 실제로 1,3-PDO 생산에 미치는 영향을 알아보기 위한 연구가 이뤄졌다. 이를 위해, YqhD 의 분리, 정제를 통한 반응속도론적 측면에서 YqhD 에 대한 조사가 이뤄졌다 YqhD 의 3-HPA 에 대한 최대 활성과 특이성은 DhaT 와 비교해 더 낮은 결과를 보여주었다. 하지만 반응 가역성과 관련하여서는 가역반응이 거의 관찰되지 않았다. 이에 YqhD 를 과발현한 재조합 균주를 이용하여 미호기 조건하에서 플라스크 실험을 통해 1,3- PDO 생산을 조사하였고, 그 결과 글리세롤로부터 0.91 mol/mol (89 mM) 의 수율로 1,3- PDO 의 생산을 얻을 수 있었다. 또한 호기 조건에서도 3-HP 의 생산이 DhaT 발현 균주에 비해 상당히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 부산물인 3-HP 생산이 1,3-PROR 의 가역반응과 밀접한 관계가 있음을 확인하는 결과이다. 그러나 여전히 0.10 mol/mol 의 3- HP 생산이 확인되었으며 이는 3-HPA 로부터 3-HP 를 생성하는 aldehyde dehydrogenase (ALDH)가 존재함을 보여준다. 이러한 효소들의 결실은 P. denitrificans 에서 1,3-PDO 의 생산을 좀 더 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

글리세롤과 유전자 재조합 Klebsiella pneumoniae J2B 균주를 이용한 3-Hydroxypropionic Acid와 1,3-propanediol의 동시 생산

제경은 부산대학교 2012 국내석사

비타민 B12을 자체 생산하는 Klebsiella pneumoniae는 탈수반응을 통해 glycerol을 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA)로 전환하고 이어서 3-HPA를 1,3-propanediol (1,3-PDO)로 환원할 수 있다. 만일 K. pneumoniae 균주에 3-HPA를 산화시킬 수 있는 적절한 aldehyde dehydrogrenase가 존재한다면 K. pneumoniae 균주는 1,3-PDO와 함께 또 다른 플랫폼 화합물인 3-hydroxypropionic acid (3-HP)를 동시에 생산할 수 있다. 본 연구에서는 3-HP 및 PDO를 동시에 고효율로 생산하기 위하여, Azospirillum brasilense 유래의 KGSADH를 포함하는 재조합 K. pneumoniae 균주를 구축하였고 이 균주의 resting cell을 이용하여 3-HP와 PDO의 동시 생산을 시도하였다. 최적 생산 조건 도출을 위하여, 균주 성장 및 product 생산 각각의 단계를 2 단계로 분리하여 최적화하였다. 플라스크 및 바이오리액터 규모에서 배지조건, 환경조건 등을 달리하여 적합한 조건을 개발하였다. 그 결과 1 단계 성장 단계에서는 부분호기 조건에서 배양한 균주의 활성이 가장 높았고, 2 단계 생산 단계 연구에서는 100 mM의 글리세롤을 사용하는 플라스크 조건에서 80% 이상의 수율로 3-HP 및 PDO를 동시에 생산할 수 있었다. 또한 5M NaOH 용액을 이용하여 pH를 7로 일정하게 유지시킨 바이오리액터 실험의 결과, 12시간에서 최대 125.64mM 3-HP 및 209.54mM PDO를 수율74%로 생산할 수 있었다. 이 때, 생산성은 28mmol/L/h이었다. 이 연구의 결과는 상기 균주가 3-HP 및 PDO를 상업적 규모로 동시에 생산할 수 있는 가능성을 가지고 있으며 resting cell system이 좋은 생산 system이라는 것을 증명한다. 향후 생산조건 최적화에 따라 더욱 높은 생산성을 달성할 수 있을 것이다. In the present study the resting cell system of recombinant Klebsiella pneumoniae J2B strain (with overexpression of KGSADH gene) was used for the co-production of 3HP and PDO from glycerol by using a two-stage process involving physical separation of growth and production phase from each other. In the first stage an active biomass was produced which was followed by the transfer of cells to the bioconversion medium (containing glycerol in potassium phosphate buffer) in the second stage. Initially, the culture conditions for both the stages were optimized. At shake flask level, an active biomass grown under microaerobic conditions produced 43.23mM 3HP and 59.01mM PDO in 30min from the bioconversion of glycerol(117mM) carried out under anaerobic conditions. The fed-batch bioconversion performed in 1.5L bioreactor by using a resting cell concentration of 1.01g/LDCW under anaerobic conditions and controlled pH(7.0) resulted in 125.64mM 3HP and 209.54mM PDO in 12h with acumulative productivity, yield and specific production rate of 27.93mmol/L/h, 0.70(mol/mol) and 27.66mmol/h/gcells, respectively. It is worth mentioning that, to our knowledge, this is the first report on simultaneous production of 3HP and PDO from glycerol using a resting cell system.

Dual promoter vector를 이용한 Saccharomyces cerevisiae의 1,2-Propanediol 생산

노용호 인하대학교 일반대학원 2008 국내석사

1,2-propanediol (1,2-PD, propylene glycol)은 광학 이성질체의 구조를 가지는 3개의 탄소에 diol구조를 하고 있다. 불포화 polyester resin, 비이온성 계면활성제, 화장원료, 액체 계면활성제 등의 산업 용도로 사용이 되고 있다. 미생물 발효기술은 화학적인 방법으로 생산되는 물질을 재사용이 가능한 생산으로 변환해주는 중요한 기술이다. Yeast는 예전부터 식품에서 사용이 되어왔을 정도로 인체에 안전한 균주이고, 대사과정이 이미 많이 밝혀졌을 뿐만 아니라 유전자 정보도 공학적인 이용을 하기에 충분할 만큼 알려져 있다. 본 실험에서는 Saccharomyces cerevisiae 안에서 두 개의 목적유전자를 발현하기 위하여 multiple cloning site를 가진 expression vector를 사용하였다. S. cerevisiae에 삽입할 유전자는 mgs와 gldA이다. 이 두 유전자에서 만들어지는 효소, methylglyoxal synthase과 glycerol dehydrogenase는 각각 glucose를 이용한 1,2-propanediol 생합성 과정에 꼭 필요한 중간체인 methylglyoxal과 1,2-propanediol 생산을 하는 역할을 한다. 선정한 두 유전자 mgs와 gldA를 dual promoter vector에 삽입하였다. 유전자가 들어있는 플라스미드는 transformation을 통하여 S. cerevisiae에 삽입되고 SDC (A, T) 배지에서 선별과정을 거치게 된다. 플라스미드에서 유전자 발현의 시작을 이끄는 GAL promoter는 galactose가 존재하는 환경에서 작동을 하기 때문에, 배지에 첨가되는 galactose의 양을 결정하였다. 그리고 promoter가 가장 높은 활성을 갖는 정체기에서 1,2-propanediol의 농도를 측정하였다. 1,2-propanediol의 정량분석을 위하여 refractive index detector를 사용한 HPLC 분석을 하였다. Mobile phase는 0.5M sulfuric acid를 사용하였고, flow rate는 1.0 mL/min이었다. 실험결과 47시간 배양 후, 배지의 glucose와 galactose의 양이 각각 0 g/L, 20 g/L인 경우에 가장 많은 1,2-propanediol 생산량을 보였으며, 0.2142 g/L의 생산량을 보였다. 1.2-propanediol (1,2-PD, propylene glycol) is an enantiomer having three carbon-diol structure. It has a number of applications in the production of unsaturated polyester resins, nonionic detergent, cosmetics, liquid detergents, and others. Microbial fermentation is an important technique for the conversion of renewable resources to industrial chemicals. Yeast is generally regarded as safe (GRAS), metabolism is studied widely, and various genetic systems are available for engineering. In this study, Saccharomyces cerevisiae was used a host strain and the expression vector which has two cloning sites was used as a host strain. The target genes are mgs and gldA. Methylglyoxal synthase and glycerol dehydrogenase are made from mgs and gldA. In the metabolism of glucose, methylglyoxal synthase convert to methylglyoxal which is a key intermediate from DHAP and glycerol dehydrogenase produce 1,2-propanediol. The plasmid contained mgs and gldA was inserted into S. cerevisiae by yeast transformation. And then S. cerevisiae was screened by SDC (A, T) medium. The quantity of galactose in the medium was determinated because the GAL promoter that activate the target genes is induced by galactose. The concentration of 1,2-propanediol was analyzed by HPLC with refractive index detector. The mobile phase was 0.5M sulfuric acid and flow rate was 1.0 ml/min. After the 47hours period, 1,2-propanediol concentration was observed 0.2142 g/L under the condition of 0 g/L: 20 g/L (glucose: galactose).

Clostridium butyricum 유래 이종 유전자를 발현하는 형질전환 Escherichia coli 에서의 1,3-propanediol 생산

박보영 아주대학교 대학원 2013 국내석사

1,3-Propanediol (1,3-PD) production by fermentation of glycerol was first described in 1881 but little attention was paid to this biosynthesis for over a century. 1,3-PD is an industrially valuable chemical intermediate with potential uses in the production of polymers (polyesters, polyethers, polyurethanes), cosmetics, foods, lubricants, medicines and as an intermediate for the synthesis of heterocyclic compounds such as indole and quinolines. Growing price of crude oil and fuels for transportation sectors have resulted in a rapid growth in biodiesel production worldwide. An increase of biodiesel production leads thus to an increase of the quantity of the primary co-product, glycerol. Since the existing glycerol supply and demand market is tight, the recent increase in glycerol production from biodiesel refining has created a glut in the glycerol market. It is estimated that the world biodiesel market will achieve the quantity of 37 billion gallons by 2016, which means that significantly more than four billion gallons of crude glycerol will be produced every year. The high growth rate of biofuel market and the perspective of glycerol becoming abundant attract even more attention to this valuable chemical. I studied about strain improvement and optimization of culture condition for 1,3-PD production by Escherichia coli. In this study, I constructed pQE30 – B12rY using dhaB gene from Clostridium butyricum KCTC3700 and yqhD gene from Escherichia coli JM109. As a result, I could achieve 2.5 g/L 1,3-PD from recombinant Escherichia coli B12rY for 12 hours. 석유자원의 고갈에 대비한 바이오 디젤의 생산이 가속화됨에 따라 바이오 디젤 생산의 부산물인 glycerol이 상당히 많이 발생하고 있다. 때문에 본 연구는 바이오 디젤 생산으로 발생하는 glycerol을 이용하여 다양한 용도로 사용되는 화학물질인 1,3-propanediol을 생산하는 Escherichia coli 균주의 개발을 목적으로 하였다. 1,3-Propanediol을 생산하는 E. coli 균주 개발은 자연적인 1,3-propanediol 생산 균주들이 가지는 병원안전성 문제와 독성물질 및 glycerol 대사 부산물 문제를 해소함으로써 공정설비를 간소화 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 개발된 1,3-propanediol 생산 E. coli는 형질도입된 재조합 plasmid를 통해 Clostridium butyricum 유래의 glycerol dehydratase (GDHt)와 E. coli 유래의 1,3-propanediol dehydrogenase (1,3-PD DH)를 발현하는 균주로서, 이 효소들을 이용하여 glycerol로부터 1,3-propanediol을 생산한다. 또한 효소활성에 대한 coenzyme으로 vitamin B12를 필요로 하지 않는 vitamin B12 independent GDHt를 이용하므로 1,3-propanediol 생산 시 고가의 vitamin B12를 첨가할 필요가 없어 경제적인 공정 설계가 가능하다.

Clostridium butyricum Dha operon을 갖는 재조합 대장균에서의 glycerol로부터 1,3-propanediol 생산

김의민 아주대학교 2014 국내석사

석유자원의 고갈에 대비한 바이오 디젤의 생산이 가속화됨에 따라 바이오 디젤 생산의 부산물인 glycerol이 상당히 많이 발생하고 있다. 때문에 본 연구는 바이오 디젤 생산으로 발생하는 glycerol을 이용하여 다양한 용도로 사용되는 화학물질인 1,3-propanediol을 생산하는 Escherichia coli 균주의 개발을 목적으로 하였다. 1,3-Propanediol은 주로 부동액, 의약품, 화장품 등의 다양한 용도로 사용되며, 특히 polytrimethylene terephthalate (PTT) polymer 합성에 사용되는 monomer로써 생물공정을 통해서 생산될 수 있는 석유 대체 물질 중의 하나이다. 1,3-propanediol 생산에 관여하는 2종류의 효소는 glycerol dehydratase와 1,3-propanediol dehydrogenase로, 순차적인 반응에 의해 1,3-propanediol 생산된다. 1,3-propanediol의 생산에 관여하는 외래 유전자를 도입한 재조합 E. coli를 개발하고자 1,3-propanediol을 생산하는 균주 중 Clostridium butyricum 균주로 부터 고가의 coenzyme B12를 필요로 하지 않는 glycerol dehydratase인 dhaB1, dhaB2 유전자를 클로닝 하고, coenzyme의 활용을 NADH 외에도 NADPH로 넓혀 3-HPA의 축적이 이뤄지지 않게 할 목적으로 E. coli JM109로부터 1,3-propanediol dehydrogenase 인 yqhD 유전자를 클로닝 하여 glycerol로부터 1,3-propanediol을 생산하기 위한 여러 종류의 재조합 E. coli를 구축하였다. 각각의 재조합 E.coli에서의 단백질 발현은 IPTG로 유도하였고, SDS-PAGE로 확인하였다. 생성물 측정을 위해 재조합 E.coli를 먼저 호기조건에서 초기 배양하고 혐기조건에서 단백질 발현을 유도하면서 배양하였다. 혐기조건에서의 E.coli의 성장을 향상시키기 위해 배지최적화 실험을 진행하였고, 질소원과 탄소원으로 각각 ammonium sulfate, fumaric acid를 추가적으로 선택할 수 있었다 결과적으로 glycerol 10g/L, ammonium sulfate 3g/L, fumaric acid 3g/L가 추가된 LB medium으로 재조합 E.coli B21rY를 배양하여 2.71g/L의 1,3-propanediol을 생산할 수 있었다.

Aryl-1,3-propanediol thiourea 유도체의 합성과 항암활성

권오혁 中央大學校 大學院 2002 국내석사

We synthesized twenty aromatic ceramide derivatives and measured their cytotoxicity. Compound [5] ~ [24] are obtained with the reaction of phenylamino alcohol and isothiocyanate. We investigated cytotoxicity of twenty synthesized compounds using MTT assay with HL-60 cells. In cytotoxicity assay, we found that the compounds of [7], [8], [12] and [13] had high cytotoxic activity. From the results we suggested that compounds of [7], [8], [12] and [13] should be anticancer effects.

(Co2 + C5-diols) 2성분계 혼합물의 상거동

박경규 동아대학교 대학원 2010 국내석사

C5-diols have two hydroxyl groups in their molecular structures. The position of the hydroxyl groups of the C5-diols influence on not only their own physco-chemical properties but also their mixture properties, such as solubility and phase behavior. To elucidate the effect of molecular structure of C5-diols on the phase behavior of C5-diol mixture, the Pressure-Temperature (P-T) curve, Pressure-Composition (P-x) curves of two C5-diol isomers, 2,2-dimethyl-1,3-propanediol and 2,4-pentanediol, were determined in carbon dioxide up to 200 MPa and 403.2 K. 2,2-dimethyl 1,3-propanediol has two hydroxyl groups that are located at the opposite end site of its structure. It also has two methyl groups connected to the center carbon, which make cross-like structure. The unique molecular structure of 2,2-dimethyl-1,3-propanediol influence its ability of intra- and intermolecular hydrogen bonding. 2,4-pentanediol has two hydroxyl group at the second and the fourth carbon in its straight carbon chain, so it is expected that the degree of intra-molecular hydrogen bonding of 2,4-pentanediol is higher than that of 2,2-dimethyl- 1,3-propanediol. The two binary mixtures, (2,2-dimethyl-1,3-propanediol + CO2) and (2,4-pentanediol+CO2), exhibited fundamentally similar phase behavior. As temperatures decrease, the pressure to dissolve the diols in CO2 rapidly increase due to increasing hydrogen bonding between the diol molecules, which is unfavorable to dissolve the diol in CO2. At temperatures lower than 353.3K, 2,2-dimethyl-1,3-propanediol is not dissolved even at 200 MPa and has open loop in P-x space. 2,4-pentanediol is more soluble than 2,2-dimethyl-1,3-propanediol in CO2 especially at low temperatures, since 2,4-pentanediol can perform intra-molecular hydrogen bonding, as the result the intermolecular hydrogen bonding of 2,4-pentanediol is reduced. The experimental P-T and P-x curves were simulated with Peng-Ribinson EOS. The pure component parameters, such as critical temperature and pressure, boiling temperature, and acentric factor, of the two diols were calculated using Marrero and Gani group contribution and Amborse and Walton suggestion. Whereas the modeling with PR EOS did not exhibit quantitatively the phase behavior of the two (diol + CO2) mixtures at low temperature, the simulated P-x isotherms well agreed with the experimental data at high temperatures. The critical solution temperature loci of the two (diol + CO2) mixtures were plotted from the experimental and simulated data. Type IV critical mixture phase diagram was obtained for the (diol + CO2) mixture. 본 연구에서 사용된 C5-diol(2,2-Dimethyl-1,3-propanediol; Neopentyl Glycol), 2,4-Pentanediol)들은 분자식은 같지만 서로 다른 분자구조를 가지는 구조 이성질체이다. 2,2-Dimethyl-1,3-propanediol은 C5-diol 이성질체들과는 다르게, 분자구조의 양 끝에 2개의 히드록실기를 가지고 있으며 중간 탄소에 2개의 메틸기를 가지는 대칭적인 구조를 가진다. 2,2-Dimethyl- 1,3-propanediol은 이런 대칭적인 분자구조로 인하여 독특한 물리 화학적 특성을 가지고 있다. 2,4-pentanediol은 탄소 주사슬 2번 4번 탄소에 히드록실기를 가지고 있다. 본 연구에서는 초임계 이산화탄소 내에서 C5-diol들의 히드록실기의 위치에 의하여 C5-diol들의 상거동과 용해도가 어떻게 영향을 받는지 규명하였다. 2,2-Dimethyl-1,3-propanediol + CO2, 2,4-Pentanediol + CO2 2성분계 혼합물의 bubble-point curve, dew-point curve, cloud-point curve, mixture critical point를 200 ㎫, 403.15 K 까지 측정하였다. 측정한 V-L-E 자료들을 Peng-Robison 상태방정식을 이용하여 모사하였다. 모사에 사용된 임계압력과 임계온도는 Marrero and Gani의 group-contribution 방법1으로, acentric factor는 Amborse and Walton 방법과 Pitzer relation2을 사용하여 계산하였다. 두 물질의 critical mixture locus를 비교하여 보면 2,4-pentanediol의 단일상 영역이 2,2-dimethyl-1,3-propanediol의 단일상 영역보다 넓다는 것을 확인할 수 있다. 이것은 2,4-pentanediol이 2,2-dimethyl-1,3-propanediol보다 CO2와의 용해도가 크다는 것을 보여준다. CO2와의 용해도를 결정하는 것은 C5-diols의 분자간 또는 분자내의 수소결합의 영향을 받는다. 2,4-pentanediol의 수소결합의 크기가 2,2-dimethyl-1,3-propanediol의 수소결합의 크기보다 작다는 것을 보여준다. 두 C5-diol의 분자구조를 보면 2,4-pentanediol은 분자내의 수소결합이 가능한 구조를 가지고 있지만 2,2-dimethyl-1,3-propanediol은 중간탄소에 2개의 메틸기가 위치하고 있기 때문에 분자간의 수소결합을 하기 어려운 구조를 가지고 있다. 그러나 분자들간의 수소결합을 하기에는 더 유리한 구조를 가지고있다. 분자간 또는 분자들의 수소결합의 세기가 2,2-dimethyl-1,3-propanediol이 2,4-pentanediol 보다 더 크기 때문에 CO2와의 용해도는 낮다. PR-EOS로 모사한 결과에서 고온영역에서는 실험적 데이터와 비교적 잘 일치하나 저온영역에서는 잘 맞지 않는다. 이유는 PR-EOS는 극성인력이나 수소결합에 대한 영향을 잘 반영하지 못하기 때문이다.

Dual vector system에 의한 Saccharomyces cerevisiae의 1,2-Propanediol 생산

김소영 인하대학교 일반대학원 2008 국내석사

1,2-Propanediol은 석유제품으로부터 생산되어지는 유용한 화학물질이다. Metabolic engineering을 통하여 1,2-PD를 생산하고자 하는 균주인 Saccharomyces cerevisiae는 sequence가 다 밝혀져 있으며 공업적으로 많이 사용되고 있는 균주이다. 이 연구에서는 S. cerevisiae로부터 1,2-PD의 생산성을 향상시키고자 하였다. 1,2-PD의 생산을 위해서 Escherichia coli K-12로부터 획득한 methylglyoxal synthase (mgs) gene과 glycerol gehydrogenase (gldA) gene을 high copy number vector인 pYES2/CT와 pYES3/CT에 각각 클로닝하였다. mgs와 gldA gene을 도입시킨 후 1,2-PD의 생산은 HPLC로 분석하였다. pYES2/CT와 pYES3/CT는 GAL1 promoter가 존재한다. 그렇기 때문에 GAL1 promoter로 부터의 단백질의 발현을 유도하기 위해 배지에 galactose를 첨가해주어야 한다. 배지 내 galactose의 농도를 다양하게 해주어 β-galactosidase specific activity를 측정하였다. β-galactosidase specific activity가 최대로 측정되는 지점을 찾아 galactose의 농도와 회수시간을 결정하였다. 그 결과 β-galactosidase specific activity가 최대로 측정된 yeast extract 10 g/l, peptone 20 g/l, glucose 15 g/l, 그리고 galactose 5 g/l의 배지에서 배양 후 41시간 째 회수하기로 결정하였다. 1,2-PD의 분석결과, mgs와 gldA 두가지 유전자가 도입된 균주에서 0.19 g/l 로 높은 수준의 1,2-PD 생산량을 보였다. 1,2-Propanediol (1,2-PD) is a commodity chemical that is currently produced from petrochemical derivatives. Saccharomyces cerevisiae is well characterized and a successful industrial microorganism to enable the improvement of the 1,2-PD production by metabolic engineering. In this work, a strain of S. cerevisiae was engineered for the production of 1,2-PD. For production of 1,2-PD, methyglyoxal synthase gene (mgs) and glycerol dehydrogenase gene (gldA) from Escherichia coli K-12 were cloned onto high copy number pYES2/CT and pYES3/CT plasmid, respectively. After introducing the mgs and gldA genes, production of 1,2-PD was analyzed by HPLC. The pYES2/CT and pYES3/CT vectors contain the GAL1 promoter. To induce expression of protein from the GAL1 promoter, galactose was added to the medium. The effect of galactose concentration in medium was examined. Harvest time was determined by β-galactosidase specific activity. Maximum β-galactosidase specific activity was obtained after 41 h of growth in YPDG medium containing 1.5% glucose and 0.5% galactose. The strain containing plsmids which contained mgs and gldA genes respectively showed the highest level of 1,2-PD. 1,2-PD production was improved to 0.19 g of 1,2-PD per liter when mgs and gldA genes were expressed.