카드뮴에 노출된 마우스 신장세포에서 자가포식 손상과 p53 응집에 의한 세포사멸 유도에 관한 연구 = Impairment of autophagy induces p53 aggregation-mediated apoptosis in cadmium-exposed mouse kidney cells

국문 초록 (Abstract)

스트레스에 의해 유전자의 손상을 받게 되면, 세포는 p53 의존성의 세포자가포식을 유도한다. 본 연구는 세포질 존재 p53이 카드뮴 독성에 의한 세포사멸 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 신장 사구체 세포 (MES13E)에서 밝혔다. MES13E 세포에 카드뮴 노출은 카스 페이스 의존성 PARP-1 절단과 소포체 스트레스 매개 CHOP의 유도를 통해 세포사멸을 유도했다. 카드뮴에 노출된 ME13E 세포에서 p53 단백질은 단량체 p53 및 폴리 유비퀴틴 화된 p53 (polyUb-p53)으로 발현되었다. 단량체 p53은 카드뮴의 농도와 노출 시간에 의존적으로 감소되었다. PolyUb-p53은 세포질에서 일시적인 축적 현상과 함께 응집 현상을 나타냈으며, 이 결과는 프로테아좀 활성에 비의존적인 것으로 확인 되었다. 카드뮴 처리 후 세포 자가포식 기질인 p62 / sequestosome-1 (SQSTM1)는 면역 침강 분석에 의해 유비퀴틴 (Ub) 과 상호 작용하는 것으로 확인되었다. p62 단백질은 단량체 및 폴리 유비퀴틴화 (polyUb) 된 형태로, 세포질에서 일시적으로 축적되었으며, 축적 패턴은 p53의 축적 패턴과 유사했다. 면역 침강분석에 의해 p53은 Ub 및 p62과 상호 작용하는 것으로 규명하였다. p62의 유전자 발현 억제는 polyUb-p53을 억제하였으며, 단량체 p53의 핵으로의 이동을 증가시켰다. 자가포식 관련 유전자 Atg5의 발현 억제는 카드뮴 유도 polyUb-p62 및 polyUb-p53을 억제하고 단량체 p53의 핵으로의 이동을 증가시켰다. LC3B의 면역 침강분석을 통해 LC3B는 p53 및 p62와 상호 작용하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 p53의 단백질 수준과 세포 내 분포가 p62 매개 세포 자가포식작용에 의해 조절됨을 나타낼 뿐 아니라 세포질 내의 축적이 세포 자가포식작용의 일시적인 손상에 의해 초래되었음을 나타낸다. 결론적으로, 본 연구 결과는 polyUb-p62에 의해 p53이 세포 자가포식 소포로 이동된 후 일시적인 축적을 통해 세포사멸을 유도함으로써, 이는 카드뮴에 의한 세포 및 신장의 조직 손상에 중요한 역할을 한다는 결과를 보여준다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Upon genotoxic stress, cells can induce p53-dependent autophagy. Here we show that cytoplasmic p53 plays a critical role in cadmium (Cd) induced apoptosis in kidney messangial cells (MES13E), which was regulated by p62-mediated autophagy. Cd exposure to MES13E cells induced apoptosis through caspase-dependent PARP-1 cleavage and endoplasmic reticulum (ER) stress-mediated CHOP induction. In Cd-exposed ME13 cells, p53 protein detected as monomeric p53 and poly-ubiquitinated (PolyUb)-p53 forms. Monomeric p53 decreased concentration- and exposure time-dependent manner, and PolyUb-p53 transiently accumulated and revealed aggregated in the cytosol compartment, which was independent of proteasome. After Cd exposure, p62/sequestosome-1 (SQSTM1), an autophagy substrate, interacted with ubiquitin (Ub) as demonstrated by immunoprecipitation analysis. p62 accumulated in monomeric and polyubiquitinated (polyUb) forms, and their accumulation patterns were similar as those of p53. Immunoprecipitation analysis revealed that p53 interacted with Ub and p62, respectively. Knockdown of p62 suppressed polyUb-p53, upregulating monomeric p53, and increasing nuclear localized p53. Autophagy inhibition by knockdown of autophagy related 5 (Atg5) suppressed Cd-induced polyUb-p62 and polyUb-p53, upregulating monomeric p53, and increasing nuclear p53, indicating that p53 protein level and subcellular localization were regulated by p62-mediated autophagy. IP analysis for LC3B revealed that LC3B interacted with p53 as well as p62. Overall, our findings show that polyUb-p62 targeted p53 to autophagosomes, playing a crucial role in Cd-induced cell death and kidney damage.

목차 (Table of Contents)

• LIST OF FIGURES ------------------------------------------------- iii
• 초록 ------------------------------------------------------------------ iv
• ABSTRACT --------------------------------------------------------- vi
• ABBREVIATIONS ------------------------------------------------ viii
• 1. INTRODUCTION ------------------------------------------- 1
• 2. MATERIALS AND METHODS -------------------------- 5
• 2.1. Reagents and antibodies --------------------------------------- 5
• 2.2. Cell culture ------------------------------------------------------ 5
• 2.3. MTT assay -------------------------------------------------------6
• 2.4. Western blot analysis -------------------------------------------6
• 2.5. Transfection of siRNAs ----------------------------------------7
• 2.6. Immunoprecipitation (IP) --------------------------------------7
• 2.7. Immunofluorescence (IF) --------------------------------------8
• 2.8. Statistical analysis ----------------------------------------------8
• 3. RESILTS ------------------------------------------------------- 9
• 3.1. Cd induces apoptosis in MES13 cells ---------------------------9
• 3.2. Cd induced endoplasmic reticulum (ER) stress-mediated
• apoptosis in Cd-exposed MES13 cell -----------------------13
• 3.3. Cd induced P62-independent autophagy in MES13 cells -15
• 3.4. P62 interacts with ubiquitin (Ub) in Cd-exposed MES13
• Cells ------------------------------------------------------------- 20
• 3.5. Reponse of p53 in Cd-exposed Mes13 cells --------------- 23
• 3.6. P53 interacts with ubiquitin in Cd-exposed MES13 cells
• -------------------------------------------------------------------- 27
• 3.7. Regulation of p53 protein level is related with autophagy
• In Cd-exposed cells--------------------------------------------31
• 4. DISCUSSION ---------------------------------------------- 36
• 5. REFERENCES --------------------------------------------- 41
• 감사의 말씀 --------------------------------------------- 47