Development of novel three-dimensional tissue clearing and immunostaining method and its biomedical application

나명수 서울대학교 대학원 2022 국내박사

Tissue clearing technique has become a powerful tool for three-dimensional (3D) imaging to understand structure-function relationships at organ scale. Numerous tissue clearing methods have been introduced, but they still suffer from several limitations to be readily applied to thick biological tissues or whole organs. First, most of them require a substantial amount of time to make samples transparent. Second, some of them fail to render enough transparency in thick samples for observation under light microscope such as a confocal microscope. Third, some techniques cause serious tissue deformation during the clearing process thus do not preserve the internal structures of biological samples. The ideal tissue clearing method for biomedical application should render rapid and enough transparency while preserving the structural integrity of the sample. Although various clearing methods have their pros and cons, no simple yet efficient clearing method that satisfies the above needs has not been developed. Another issue with tissue clearing technique is whether the post-staining with either antibodies or fluorescent probes after clearing is possible. This is critical for biomedical application since immunostaining with antibodies is one of the routine experimental procedures to address the question regarding the presence and location of specific proteins in the tissues. Since most tissue staining methods still depend on diffusion of staining probes, unlike thin samples, the penetration of antibodies or other probes deep inside thick tissues to stain samples uniformly remains a very challenging task in terms of time and effectiveness. Several techniques for applying external forces such as centrifugation or electric field to solve this limitation have been developed, but they suffer from severe tissue damage that hampers them to be applied to biomedical study. First, I developed a novel tissue clearing method called SCARF, a sodium cholate (SC)-based active delipidation to clear and immunolabel thick tissues or whole organs. Theoretically, detergents that form smaller micelles and higher critical micelle concentration (CMC) should perform better and I found that SC has superior properties to sodium dodecyl sulfate (SDS), which is widely used to remove lipid from tissue. By combining it with an ion-conductive film, provides remarkably faster, superior tissue clearing and immunolabeling than SDS-based methods for a variety of organ tissues while excellently preserving the endogenous fluorescence. Next, to overcome slow staining process in thick tissue, I developed an advanced staining platform named EFIC in which a magnetic force focuses the electric field by bending it onto the sample. I found that EFIC achieved rapid and uniform staining of various proteins over the entire depth of tissue with maintaining nanoscale structural integrity. EFIC stained tau deposits and the vascular structure in the post-mortem human brain of Alzheimer’s disease and intracerebral hemorrhage, respectively, enabling quantitative analysis. Then, the developed SCARF clearing and EFIC staining were combined and applied to the kidney and cochlea tissue, demonstrating the scalability and efficiency for biomedical applications. I applied novel clearing/staining methods to the CTIN mouse used as a model of chronic kidney disease with tubulointerstitial fibrosis and successfully obtained 3D imaging. And I present evidence that fibrosis occurs along the sympathetic nerve in the CTIN model using 3D analysis. Another application is the cochlea, which has limitations in clearing and staining because it is surrounded by the cochlear bone. I found that cochlear was effectively cleared using SCARF while maintaining a high integrity of the tissue, and the cochlea was also successfully stained using EFIC. In this study for my dissertation, I have developed a novel tissue clearing method called SCARF that meets the above requirements. In addition, I have developed a rapid, simple, and scalable staining method called EFIC for uniform staining of deep tissue structures while minimizing structural deformation. Combining these two novel tissue clearing and staining methods, I proved that they can successfully be applied to various biological samples and organs to visualize the 3D internal structures in detail, thus providing valuable information that is otherwise hidden under deep inside the opaque 3D structures. 조직 투명화 기술은 크기가 큰 조직에서도 구조-기능 연관성을 밝힐 수 있는 강력한 기술이다. 여러 많은 투명화 기술이 개발되었지만, 개발된 기술들은 두꺼운 생체 조직이나 장기에 적용하기에는 여러 한계점이 존재하였다. 첫째로 대부분 투명화 기술들이 샘플을 투명하게 만들기 위해서는 많은 시간이 필요하다. 두번째로 몇몇의 기술은 두꺼운 샘플에서 공초점 현미경을 이용한 3차원 이미징을 할 수 있을 만큼 충분한 투명도를 얻지 못하였다. 세번째로 몇 개의 개발된 기술들은 투명화 과정에서 심각한 조직 손상을 일으켜서 생체 조직의 내부 구조를 유지시키지 못하였다. 조직 투명화 기술을 의과학적 적용하기 위해서는 높은 투명도를 빠른 시간내에 확보하면서 동시에 샘플의 구조적 온전성을 유지해야 된다. 비록 다양한 투명화 방법의 장단점이 존재하지만, 위의 요구를 만족시키는 간단하면서 효율적인 투명화 방법은 아직까지 개발되지 않았다. 조직 투명화 기술의 또 다른 쟁점은 투명화 이후 항체나 형광 프로브를 이용한 조직 염색의 가능 여부다. 이는 투명화 기술의 의과학적 적용하는데 있어 중요한 쟁점이다. 항체를 이용해 조직에 염색하는 방법은 조직의 특정 단백질의 유무나 위치를 알아내기 위한 주된 실험적 기법이기 때문이다. 지금까지 대부분의 조직 염색은 프로브의 확산에 의존하고 있기 때문에, 얇은 조직과 달리 두꺼운 조직에서는 항체나 프로브가 조직 깊숙이 침투하여 균일하게 염색하는 것은 시간과 효율적인 측면에서 매우 어려운 작업이었다. 이러한 한계를 해결하기 위해 원심분리나 전기장 외력을 이용한 여러 기술들이 개발되었지만, 의과학적 연구에 적용하기에는 조직 손상의 문제가 있었다. 첫번째로, SC (sodium cholate)를 이용하여 두꺼운 샘플 및 장기 들을 능동적으로 탈지질 시킴으로써 조직 투명화 시키는 방법 (SCARF라 명명)을 개발하였다. 이론적으로, 작은 마이셀을 형성하고 높은 임계농도를 가진 계면활성제가 조직 투명화에 효과적인데, SC가 기존 실험에서 널리 사용하던 SDS (sodium dodecyl sulfate )보다 더 나은 대안 물질 로서의 우수한 특성을 가지고 있음을 발견했다. 개발된 SCARF 기술은 전도성 막을 이용하여, 다양한 조직 들을 SDS를 이용한 투명화 방법보다 훨씬 더 빠르게 투명화 시켰으며, 내재된 형광 단백질을 완벽하게 보존시키고 또한 항체염색도 효과적으로 수행하였다. 또한 두꺼운 조직의 느린 염색문제를 해결하기 위해서, 자기장의 힘을 이용하여 전기장을 샘플로 초점화 시키는 EFIC이라는 새로운 염색 플랫폼 개발하였다. EFIC 염색 기술은 미세한 구조적 온전성을 유지하면서 조직의 전체 깊이에 걸쳐 있는 다양한 단백질들을 빠르고 균일하게 염색할 수 있음을 확인하였다. EFIC을 이용하여 알츠하이머 질병 사후 인간 뇌에서 Tau의 축적현상과 뇌출혈이 일어난 사후 인간 뇌에서 혈관 구조를 성공적으로 염색하고, 구조적 정량분석을 할 수 있었다. 개발된 SCARF 투명화와 EFIC 염색법을 결합하여 신장과 달팽이관 조직에 적용함으로써 의과학적 응용분야의 확장성과 효율성을 입증하였다. 세뇨관 섬유증이 발생하는 만성 신장 모델인 CTIN 쥐에 새로운 투명화/염색방법을 적용하였고 3D 영상을 성공적으로 획득하였다. 그리고 3D 분석을 이용하여 CTIN 모델에서 교감신경에 따라 섬유화가 발생한다는 증거를 제시하였다. 또 다른 응용 분야는 달팽이관인데, 뼈로 둘러싸여 있어 투명화 및 염색에 한계가 있었다. SCARF가 조직의 온전성을 유지하면서 달팽이관을 효과적으로 투명화 시켰으며, EFIC을 사용하여 달팽이관이 성공적으로 염색됨을 확인하였다. 본 논문에서는 위의 요구 사항을 모두 만족시키는 새로운 투명화 기술 (SCARF)를 개발하였다. 또한 빠르고 간단하며 확장성이 높은 염색 기술 (EFIC)을 개발하였으며, 개발된 염색 기술은 구조적 변형을 최소화하면서 조직을 균일하게 염색함을 확인하였다. 두가지 새로운 조직 투명화 및 염색 기술을 결합함으로써 다양한 의과학적 샘플과 장기에 성공적으로 적용하였으며, 3 차원적으로 내부 구조를 자세하게 시각화 함으로써 내부 깊숙이 숨겨져 있었던 생물학적 가치가 있는 정보를 제공할 수 있음을 증명하였다.

Immunobiological Activity of Mycobacterium tuberculosis Rv1605 protein

이재휘 忠南大學校 大學院 2019 국내석사

결핵 단백질 Rv1605의 면역생물학적 활성 이 재 휘 충남대학교 대학원 의과학과 의과학 전공 (지도교수 김 화 중) 결핵은 결핵균에 감염에 의해 발병하는 질병으로, 세계적으로 가장 위험하다고 알려진 질병들 중 하나이다. 세계 인구의 1/3이 감염되어 있으며, 2017년 WHO 결핵 보고서에 의하면 1000만명의 사람들이 결핵균에 감염되었고, 160만명의 사람들이 이로 인해 사망했다고 한다. 현재 결핵 백신으로 사용 가능 한 것은 BCG가 유일하며, BCG는 결핵 감염에 대한 보호율은 매우 다양하며 이 보호는 최대 20년까지 지속된다. 하지만, BCG에 의한 보호 기간이 끝난 성인의 경우 결핵에 대한 예방효과를 낼 수 없다. 따라서 BCG를 대체하거나 효과를 증폭시킬 수 있는 새로운 백신의 개발이 필요하다. BCG를 대체할 백신개발에 있어서 면역원성이 결핵균의 아단위 백신 연구가 활발하게 이루어지고있다. 결핵은 다제내성 결핵의 보조제와 함께 오랜 기간 치료를 필요로 하며, 광범위한 약물 내성 결핵으로 인하여 치료하기 어려운 질병이다. 따라서 치료 결핵 백신 개발이 중요해지고 있다. 게다가, 최근 백신 연구는 IFN- γ를 분비하는 CD4+ T세포의 활성을 유도하는 것에 중점을 두고있다. Th1 반응은 IFN- γ를 분비하여 대식세포를 더욱 활성화시켜 세포내 미생물을 제거하는데 필수적이기 때문에 결핵균을 성장을 조절하는데 있어서 중요하다. T 세포의 분화는 항원제시세포에 의해 항원이 제시되었을 때 분화가 진행되는데. 이 항원 제시의 기능에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 세포는 수지상세포이다. 이전 연구에서 결핵균 항원 중 결핵 환자의 진단에 사용할 Rv1605 재조합 단백을 포함한 여러 재조합 단백질을 제작 및 정제하였다. 결핵 환자와 건강한 공여자의 말초혈액단핵세포를 분리하여 Rv1605 재조합 단백질을 처리하여 인터페론감마분비검사(IGRA)를 진행하였다. 이 진단 결과에서 흥미로운점은 Rv1605를 건강한 공여자의 말초혈액단핵세포에서 다른 재조합 단백질과는 다르게 매우 높은 수준의 인터페론감마 분비가 검출되었다. 이전 연구를 바탕으로 Rv1605재조합 단백질의 면역학적 활성을 평가였으며, Rv1605에 의해 활성화 된 수지상 세포가 표면 분자 MHC (Major Histocompatibility Complex) I, II 와 보조 자극 인자 (CD80, CD86)를 발현하고, 전 염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-1β)을 분비를 유도하는 것을 확인하였으며, 수지상 세포와 대식세포의 MAPK와 NF-κB 신호전달 기작을 활성화하는 것을 확인하였다. 게다가 Rv1605에 의해 성숙된 수지상세포의 영향으로 Th1반응을 유도하였고 이를 통해 감염된 대식세포의 균 사멸능을 증가시켰다. 또한, BCG접종한 생쥐의 비장세포를 Rv1605로 자극을 주었을 때 인터페론감마의 분비 수준은 BCG접종하지 않은 생쥐의 비장세포의 인터페론감마의 분비 수준보다 더 높았다. 이를 통해 본 연구에서는 Rv1605에 의해 유도되는 수지상세포의 기능적 변화와 활성을 분석하였다. 또한 Rv1605 단백질이 T세포의 활성화와 분화를 유도하여 대식세포의 균 사멸기전을 활성화 시키는데 큰 역할을 하고, Rv1605가 BCG의 효과를 증폭시킬 수 있는 BCG증폭제로써의 가능성을 제시하고 있다.

알파-시뉴클린 응집체의 세포 간 전이 억제제 개발 및 기전 연구

민주옥 서울대학교 대학원 2024 국내박사

알파-시뉴클린 응집체의 세포 간 전이 억제제 개발 및 기전 연구 서울대학교 대학원 의과학과 의과학전공 민 주 옥 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease; AD), 파킨슨병 (Parkinson’s disease; PD) 및 헌팅턴병 (Huntington’s disase; HD)과 같은 신경퇴행성질환은 타우 (Tau), 알파-시뉴클린 (α-synuclein), 헌팅틴 돌연변이 (mutant huntingtin)과 같은 특정 단백질의 응집에 의한 것으로 보고되었다. 이러한 응집체의 확산은 특정 뇌 지역으로부터 세포 간 전이를 통해 다양한 뇌 영역으로 전파되고 퇴행성 질환의 진행을 야기시킨다. 특히, 신경말단에 풍부한 알파-시뉴클린의 세포 간 전이는 세포외유출/ 세포내이입 또는 터널링 나노튜브을 통해 전파 된다는 것이 많은 연구들에서 설명되었다. 하지만, 세포 간 전이에 대한 기작은 명확하게 규명되지 않았으며 이 과정을 조절하는 인자에 대해 밝혀진 바가 없다. 본 논문에서는 고속 대량 스크리닝을 통해 살아있는 세포 조건에서 알파-시뉴클린 및 헌팅틴 돌연변이의 응집체 전이를 조절하는 후보약물들을 선별하여 알파-시뉴클린 응집체 및 전이를 조절하는 기전에 대하여 규명하며 치료제로서의 가능성을 제시하였다. 본 논문의 2장에서는 Chicago sky blue 6B (CSB)가 알파-시뉴클린의 N-말단부에 직접적으로 결합함으로써 알파-시뉴클린의 섬유화를 억제함을 밝혔다. 파킨슨병 마우스 모델 (A53T)에서 CSB가 알파-시뉴클린 인산화, 신경아교증 등의 신경병리학적 특징 및 행동결손을 유의미하게 완화함을 확인하였다. CSB가 직접적으로 알파-시뉴클린에 결합하여 알파-시뉴클린의 응집을 억제함으로써 알파시뉴클린의 세포 간 전이를 막아 파킨슨병 및 시뉴클린병증 관련 치료제로서의 가능성을 확인하였다. 3장에서는 알파-시뉴클린과 헌팅틴 돌연변이 단백질 응집체 전이 세포모델에서 응집체 전이를 억제하는 조절제로 스타틴 계열 중 심바스타틴 (Simvastatin)과 프라바스타틴 (Pravastatin)이 가장 효과적으로 나타났다. 시뉴클레인병증의 마우스 모델에 스타틴 계열(심바스타틴, 프라바스타틴)을 경구 투여하였을 때, 심바스타틴이 행동 결손 및 알파-시뉴클린 축적을 효과적으로 완화하였으며, 반면에 프라바스타틴은 혈액-뇌 장벽을 투과되기 어려워 효과가 미비하였다. NPC1 (Niemann-Pick disease C1) 유전자의 결손 (knock-out) 또는 U18666A 약물처리를 통해 세포 내 콜레스테롤의 축적을 유도하는 세포 모델에서 알파-시뉴클린의 응집체 형성 및 라이소좀 세포외 분비가 증가함을 확인하였다. 반대로 콜레스테롤을 억제하는 메틸-베타-사이클로덱스트린 또는 스타틴을 처리하였을 때, 알파-시뉴클린의 응집 및 분비가 유의미하게 감소됨을 확인하였다. 이뿐만 아니라 전형성 알파-시뉴클린 피브릴을 주입한 마우스에 고지방식이를 처리하였을 때 알파-시뉴클린 병리가 악화되며 행동학적 손상을 보였다. 이때 심바스타틴을 처리한 경우, 손상된 행동결손 및 신경병리학적 특징이 유의미하게 회복됨을 확인하였다. 따라서 스타틴에 의한 콜레스테롤 레벨의 감소는 세포내 알파-시뉴클린의 응집체 축적 및 라이소좀 세포 외 유출을 통한 알파-시뉴클린의 분비를 억제함을 확인하였다. 본 논문 결과들을 통해 신경 퇴행성 질환의 치료제 개발을 위한 2가지 타겟을 제시할 수 있다: (1) 단백질 응집체에 직접적인 결합을 통한 단백질 응집체 형성 및 전이 억제 (2) 콜레스테롤 레벨 조절을 통한 단백질 응집체 전이 및 세포 내 응집 억제. 주요어 : 신경퇴행성질환, 단백질 응집체, 세포 간 전이, 알파-시뉴클린, 헌팅틴, 고속 대량 스크리닝 학 번 : 2017-35708 Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), and Huntington's disease (HD) have been reported to be associated with the aggregation of specific proteins such as Tau, alpha-synuclein (α-synuclein), and mutant huntingtin. The spread of these aggregates, through intercellular transmission from specific brain regions to various areas, contributes to the progression of degenerative disorders. In particular, the intercellular transmission of alpha-synuclein, abundant in neuronal terminals, has been described in numerous studies to occur through cell-to-cell propagation via exocytosis/ endocytosis or tunneling nanotubes. However, the mechanisms underlying cell-to-cell transmission remain unclear, and factors regulating this process have yet to be elucidated. This paper identifies candidate compounds, screened through high-throughput assays under live cell conditions, that regulate cell-to-cell transmission of alpha-synuclein and mutant huntingtin aggregates. The study aims to elucidate the mechanisms governing the regulation of alpha-synuclein aggregates and transmission, providing insights into potential therapeutic avenues for these disorders. In Chapter 2 of this paper, it is revealed that Chicago sky blue 6B (CSB) inhibits the fibrillization of alpha-synuclein by directly binding to its N-terminus. The study confirms that CSB significantly alleviates alpha-synuclein phosphorylation, neuropathological features, and behavioral deficits in a Parkinson's disease mouse model (A53T). The direct binding of CSB to alpha-synuclein inhibits its aggregation, preventing intercellular transmission and suggesting the potential of CSB as a therapeutic agent for Parkinson's and synucleinopathies. In Chapter 3, statins, specifically simvastatin and pravastatin, emerge as effective regulators inhibiting aggregate transmission in a cellular model of alpha-synuclein and mutant huntingtin protein interaction. Administering statins (simvastatin, pravastatin) to a synucleinopathy mouse model effectively alleviates behavioral deficits and alpha-synuclein accumulation. Simvastatin proves more effective, while pravastatin hindered by poor blood-brain barrier penetration shows limited efficacy. Additionally, in a cellular model inducing cholesterol accumulation through NPC1 (Niemann-Pick disease C1) knockout or U18666A treatment, it is observed that cholesterol inhibition with methyl-beta-cyclodextrin or statins significantly reduces alpha-synuclein aggregation and secretion. Furthermore, treating mice injected with preformed alpha-synuclein fibrils with a high-fat diet exacerbates alpha-synuclein pathology and behavioral impairments. However, simvastatin treatment in this context significantly restores damaged behavioral deficits and neuropathological features. Therefore, the reduction in cholesterol levels by statins is shown to inhibit intracellular alpha-synuclein aggregation and extracellular release via lysosomes. The findings in this paper suggest two potential targets for the development of therapies for neurodegenerative diseases: (1) direct binding to protein aggregates to inhibit their formation and transmission and (2) regulation of cholesterol levels to inhibit protein aggregate transmission and intracellular aggregation. The research results of Chapter 2 were published in Molecular Brain (2022) and the thesis was entitled “Chicago sky blue 6B inhibits α-synuclein aggregation and propagation”. The research results of Chapter 3 were published in Cell Death and Disease (2023) and the thesis was entitled “Statins suppress cell-to-cell propagation of α-synuclein by lowering cholesterol”.

Biological equivalence study of two formulation of bazedoxifene acetate in healthy adult male volunteers

연지선 忠南大學校 大學院 2019 국내석사

Abstract Purpose: To evaluate bioequivalence by comparing the pharmacokinetic parameters AUC0-t and Cmax between two drugs after a single oral dose of a reference drug or a test drug containing 22.6 mg of Bazedoxifene acetate and to determine adverse events, evaluate safety items such as adverse reactions, concomitant medication, physical examination, vital signs, clinical laboratory examination, and ECG. Subjects and Methods: This randomized, open-label, single-dose, two-treatment, two-sequence, two-way crossover study was conducted on 52 healthy adult males. The subjects were administered VIVIANT TAB. 20mg (Bazedoxifene acetate 22.6 mg) and VIVANT TAB 20mg (Bazedoxifene acetate 22.6 mg)and blood samples were collected a total of 32 times for 96 hours. The concentration of Bazedoxifene, which is unchanged in plasma, was applied to the test sample analysis after validation for selectivity, linearity, accuracy, precision and stability line using LC-MS / MS. Results: Of the total 60 volunteers, 52 were selected and 45 pharmacokinetic analyzes were conducted among the subjects who had completed the entire bioequivalence study schedule. For comparison and evaluation of the pharmacokinetic parameters of Bazedoxifene in this bioequivalence study, the plasma concentration of Bazedoxifene when administered with the reference drug and the test drug was adjusted to the GMR 1.0106 (0.9345, 1.0929) for AUC0-t after the administration of both the reference drug and the test drug Exposure was equivalent and Cmax was 0.9913 (0.8828, 1.1132). Conclusion: In this bioequivalence study, AUC0-t and Cmax met the "drug equivalence test criteria" that should be within log 0.8 to log 1.25. It was confirmed that the biological equivalence of the test drug with the reference drug containing 22.6 mg of Bazedoxifene acetate was equivalent. 국문 초록 건강한 성인 남성 지원자에서 bazedoxifene acetate의 2 가지 제제의 생물학적 동등성에 대한 임상 시험. 연지선 충남대학교 대학원 의과학과 의과학전공 (지도교수 홍장희)   목적: Bazedoxifene acetate 22.6 mg을 함유하는 대조약 또는 시험약의 두 제제를 1정 공복 투여한 후 두 제제간의 약동학적 평가변수 AUC0-t 와 Cmax 를 비교하여 생물학적 동등성을 평가하고 이상반응, 병용약물, 이학적 검진(신체검진), 활력징후, 임상검사실검사, 12 전극 심전도검사(ECG) 등의 안전성 항목에 대하여 비교 평가하고자 한다. 대상자 및 방법: 이 연구는 공개, 무작위배정, 공복, 단회, 경구 투여, 2 군, 2 기, 교차시험으로 52명의 건강한 성인 남성을 대상으로 실시되었다. 제 1 기에는 A 군에 대조약인 한국화이자제약㈜ “비비안트정 20 밀리그램(바제독시펜아세테이트)” 1 정을, B군에 시험약인 ㈜휴온스 “비반트정 20 밀리그램(바제독시펜아세테이트)” 1 정을 투여하였다. 제 2 기에는 A 군에 시험약을, B 군에 대조약을 교차 투약하였다. 제 1 기와 제 2 기 투약 사이에는 14 일(2 주) 이상의 휴약기간을 두었으며 실제 수행된 휴약기는 14 일이었다. 채혈은 투약 전 (0hr), 투약 후 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 및 96 h 각 기별 16 회 (총 32 회) 로 진행되었다.혈중 Bazedoxifene 의 분석은 LC-MS/MS 를 이용하여 선택성, 직선성, 정확성, 정밀성 및 안정선 등에 대한 validation 을 완료한 후 시험시료 분석에 적용하였다. 결과: 총 60명의 자원자중 52명이 스크리닝을 통과하여 대상자로 선정되었고, 그중 전체 생물학적 동등성시험 일정을 완료한 45명의 대상자를 대상으로 약동학 분석을 실시하였다.

Factors Influencing the Schreiner Effect in Inner Ear Gene Therapy

안은경 충남대학교 대학원 2025 국내석사

내이 유전자 치료에서 슈라이너 효과에 영향을 미치는 요인 안 은 경 충남대학교 대학원 의과학과 의과학전공 (지도교수 최 진 웅) 슈라이너 효과는 바이러스 벡터를 한쪽 귀에 투여하여 뇌척수액(CSF) 경로를 통해 반대쪽 귀의 세포를 형질감염시키는 현상으로, 내이 유전자 치료에 기회와 과제를 모두 제공한다. 이 연구는 슈라이너 효과에 영향을 미치는 요인을 평가하고, 바이러스 벡터 유형과 복용량에 초점을 맞추고, 양측 형질감염에 대한 의미를 평가하는 것을 목표로 한다. 내이에 높은 트로피즘을 가진 두 바이러스 벡터인 아데노 관련 바이러 스 PHP.eB와 AAV2.7m8을 C57BL/6 마우스의 후반원관에 1ul, 2ul, 4ul 의 용량으로 투여했다. 치료한 귀와 치료하지 않은 귀 모두에서 기저, 중간, 정점 달 팽이관 회전에서 내모세포와 외모세포의 형질감염 효율을 평가했다. 면역조직화 학 및 GFP 기반 세포 계수를 사용하여 형질감염을 정량화했고, 통계 분석을 수 행하여 형질감염률을 비교했다. 두 벡터 모두 치료된 귀에서 용량 의존적 형질감염률을 보였으며, 4ul에 서 가장 높은 효율이 관찰되었다. 내모세포는 모든 달팽이관 회전에서 외모세포 보다 더 높은 형질감염률을 보였다. 치료되지 않은 귀에서도 형질감염률은 용량 의존적이었으며, 내모세포는 20-40%, 외모세포는 10-30%에 도달했다. 두 벡 터 간에 통계적으로 유의미한 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 유사한 효능을 시 사한다. 이러한 결과는 단측 유전자 전달을 통해 양측 형질전환 유전자 발현을 가능하게 하는 슈라이너 효과의 잠재력을 강조한다. 이 접근 방식은 양측 유전적 청력 상실에 대한 유전자 치료 프로토콜을 단순화하고 치료 결과를 개선할 수 있다. 장기적인 효능과 기능적 이점을 탐구하고 이러한 결과를 임상 응용 프로그 램으로 전환하기 위한 기반을 제공하기 위한 추가 연구가 필요하다. 주요어 : 슈라이너 효과, 진 테라피. AAV virus

초고자장 7T 자기 공명 영상 장치를 이용한 기능성 자기 공명 혈관 조영술 기법

박찬아 가천의과학대학교 대학원 2009 국내석사

기능적인 신경 활동의 변화를 보기 위한 방법으로 현재 기능성 자기 공명 영상 기법 (fMRI)이 인간을 대상으로 널리 쓰이고 있으나 혈관의 직접적인 관측은 이루어지고 있지 않다. 동맥과 정맥, 더 나아가 모세 혈관 수준의 신경 활동 변화를 관측할 수 있도록 혈관의 직접 촬영을 시도함으로써 뇌 기능성 연구에 새로운 발판을 마련할 수 있을 것이다. 초고자장 7T 자기 공명 시스템이 개발되면서 초고해상도 촬영을 통한 미세 혈관의 관측이 가능하기 때문에 fMRI와 같은 시간 해상도로 기능성 혈관 촬영을 수행하여 뇌 기능의 변화를 관찰할 수 있다. 뇌 기능에 대한 활발한 연구를 위하여 기능성 혈관 조영 기법 (fMRA)을 도입, 개발하여 계속적인 실험이 진행되어야 할 것이다. We propose a new type of functional imaging in magnetic resonance imaging (MRI), a functional MR angiography (fMRA). As it is known, arterial responses during neural activities have been studied in animals, but little is known about the human brain in-vivo. Proposed fMRA at ultra high field strength, 7 Tesla (T), has a potential for a direct visualization of vascular responses of those blood vessels related to the neural activity during the tasks, such as a hand movement or checker board stimulation, that is, fMRA. The results of this paper clearly indicate that there is possibility that one can directly observe the vascular changes in individual blood vessels related to the tasks in human brain in-vivo, similar to fMRI.

섭식 및 체중 조절에 있어서 시상하부 Angiopoietin like peptide-4 의 역할

김현경 울산대학교 2009 국내석사

연구배경 Angptl-4(fasting-induced adipose factor)는 angiopoietin-like protein familty에 속하는 약 70Kd 크기의 단백질로 N-terminal domain은 cioiled coil domain으로, C-ternimal은 fibringen like domain으로 구성되어 있다 Angptl-4는 간, 지방, 근육, 신경, 뇌하수체 등 다양한 조직에 발현되며, 혈액에서도 풍부하게 존재한다. Angptl-4는 공복 상태에서 지방 조직에 그 발현이 증가하여 이름이 붙여졌으며, 전사조절 인자인 PPAR-alpha의 ligand를 처리하면 그 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 알려진 Angptl-4의 작용으로는 신생혈관생성(angiogenesis)의 억제 및 지질대사 조절 작용이 있다. 지방세포 특이 (aP2)-promoter를 이용하여 Angptl-4 발현을 증가시킨 transgenic mouse에서는 체지방량이 감소한다고 보고되어 있으며, 이는 혈액의 중성 지방의 지방세포로의 저장의 감소 및 지질 산화의 감소에 기인한다고 알려져 있다. 선행연구를 통하여 본 연구자는 Angptl-4가 식욕과 체중 조절 중추인 시상하부에 발현이 되었음을 확인하였다. 따라서 본 연구자는 Angptl-4가 식욕 및 체중 조절에 관여할 것이다 라는 가설을 세우고, 본 연구를 진행하였다. 한편 AMP-activated protein kinase (AMPK)는 세포내 에너지가 부족한 상황에서 활성화되는 효소로, AMPK 활성화는 ATP를 소비하는 동화 작용에 관련되는 효소들의 활성을 억제하고, ATP 생산에 관련되는 효소들의 활성을 촉진함으로써 에너지 부족 상태로부터 회복을 도와주는 역할을 한다. AMPK 활성화는 운동에 의한 골격근에서의 포도당 섭취 및 지방산 산화 증가, 간에서의 지방합성 및 포도당 신생억제 및 췌장에서의 인슐린 분비를 조절하는 중요한 매개인자로 작용한다. 또한 AMPK는 중추신경계, 특히 식욕조절 중추인 시상하부에도 풍부하게 존재하며, 최근 시상하부 AMPK 활성이 먹이섭취 상태에 따라서 변화함이 보고되었다. 식욕억제 인자인 렙틴, 인슐린 및 알파-리포산 투여시 시상하부 Angptl-4의 활성이 증가하며, 그 결과 감소한 시상하부 AMPK 활성이 섭식 억제 작용의 중요한 중간 매개인자임이 보고되면서, 시상하부 AMPK가 전신의 에너지 상태를 감지하여 먹이섭취와 에너지 대사를 조절하는 "whole body enengy sensor"로 작용한다는 가설이 제시되었다. 따라서 먹이섭취 조절과 체중조절에 있어서 Angptl-4와 AMPK의 관련성에 대해서도 연구하였다. 연구목적 시상하부에서 Angptl-4의 섭식 및 체중 조절에 있어서의 역할을 규명하고, 그 분자생물학적 기전을 규명하며, Angptl-4 knockout mouse에서 섭식 및 에너지 대사의 변화를 연구하였다. 연구방법 및 내용 1) 제 3뇌실로 Angptl-4의 투여가 먹이섭취와 체중에 미치는 효과를 관찰하였다. 2) 제 3뇌실로 Angptl-4의 투여가 에너지 대사율에 미치는 효과를 관찰하였다. 3) 제3 뇌실로 Angptl-4의 투여가 섭식조절에 관여하는 시상하부 뉴로펩타이드 (neuropeptide Y, proopiomelanocortin, Agouti-related peptide, coccain amphetamine regulated peptide)의 mRNA 발현에 미치는 효과를 관찰하였다. 4) 제 3뇌실로 Angptl-4의 투여가 시상하부 및 골격근의 AMPK 활성에 미치는 효과를 관찰하였다. 5) 공복과 식사에 따른 시상하부 Angptl-4의 protein 및 mRNA의 양적인 변화를 관찰하였다. 6) Wild type mouse와 Angptl-4 knockout mouse에서 먹이섭취, 체중, 체지방량 및 에너지대사율을 비교하였다. 연구결과 시상하부에서 Angptl-4를 투여하거나 유전자를 과발현 시키면 먹이섭취와 체중이 감소하였다. Angptl-4 KO mosue에서 체중과 금식후 먹이섭취량이 증가하였다. 시상하부 Angptl-4 발현은 음식물, 영양소 및 렙틴 투여 후 증가하였다. Angptl-4 투여는 시상하부 AMPK 활성을 감소시켰고, AMPK activator 투여는 Angptl-4 의 먹이섭취 및 체중 감소 효과를 차단하였다. 결론 시상하부의 Angptl-4가 영양소에 의하여 조절을 받으며, AMPK 활성 조절을 통하여 섭식과 체중을 조절하는 새로운 섭식 조절 인자임을 제시해 준다.

TCR 과 Co-stimulatory ICD 직접 연결 엔지니어링을 통한 TCR-T 기능 향상 가능성

김종혁 울산대학교 일반대학원 2024 국내석사

This study proposes a novel approach to enhance the efficacy of adoptive T cell therapy (ACT), a form of immunotherapy for cancer treatment. Among ACT strategies, T cell receptor-engineered T (TCR-T) therapy can be applied to solid tumors by expressing TCRs on patient T cells to recognize tumor antigens and eradicate cancer cells. However, a significant challenge in ACT is the limited activation of T cells within the tumor microenvironment, leading to suppressed immune responses and reduced effectiveness. Therefore, we investigated methods to improve T cell function using the TCR-T system. Similar to techniques used in Chimeric Antigen Receptor T (CAR-T) therapies, we designed an engineering approach to directly link the intracellular domain (ICD) of co-stimulatory molecules to the TCR constant region. We aimed to assess the impact of this modification on T cell activation and anti-tumor effects. Using lentivirus-mediated gene delivery, we confirmed stable TCR expression levels in both cell lines and human primary cells. However, contrary to expectations, this modification did not enhance anti-tumor effects compared to conventional TCR in human primary cells; in some cases, these effects were diminished. Nevertheless, the engineering approach of directly linking the ICD of co-stimulatory molecules statistically significantly increased T cell activation levels compared to conventional TCR. These results resemble enhanced activation responses observed in CAR-T research, demonstrating the feasibility of a second-generation TCR-T system that successfully integrates signals 1 and 2. Therefore, the direct coupling of co-stimulatory molecule ICD to TCR via engineering provides a new strategy in TCR-T engineering to enhance ACT functionality, suggesting potential improvements in the field of immune oncology therapy

시린가레지놀이 해마 CA1의 흥분성 시냅스 전도와 피크로톡신으로 유도된 간질 유사 전기적 활성을 억제하는 기전에 관한 연구

조영선 서울대학교 2019 국내석사

신경세포 사이의 시냅스 전도는 신경세포에서 분비되는 신경전달물질에 의해 일어난다. 이 때, 신경전달물질이 분비되는 과정은 신경조절물질에 의해 촉진되거나 억제될 수 있다. 생리학적으로는 체내에서 분비되는 신경조절물질에 의해 시냅스 전도가 조절되지만, 그와 유사한 작용의 약물을 합성하거나 자연에서 추출, 정제하여 신경세포의 활성을 조절하는 데 사용되고 있다. 그 중, 식물에서 유래한 물질은 신경세포의 막수용체, 운반체 또는 이온 채널을 조절할 수 있으며, 이러한 특성에 관한 연구는 의과학 연구에 중요하다. 이에 본 연구에서는 식물에서 유래한 물질인 시린가레지놀(Syringaresinol, SYR)이 마우스 해마의 CA1 신경세포의 시냅스 전도에 미치는 영향을 확인하였다. 전기생리학 실험을 통해, 마우스의 해마 Schaffer collateral 경로를 자극하였을 때 측정되는 세포 외 흥분성 시냅스 전위(fEPSP)가 SYR에 의해 감소함을 확인하였으며, 억제성 시냅스에는 영향을 미치지 않음을 관찰할 수 있었다. SYR을 마우스 해마 CA1 슬라이스에 처리하였을 때, 쌍-펄스 비율(paired pulse ratio, PPR)이 증가하였다. 그러나 HEK293T 세포에 AMPA 수용체 발현을 유도하여 SYR을 처리하기 전, 후의 전류를 비교하였을 때 아무 변화가 관찰되지 않았다. 이를 통해 SYR이 시냅스 전 조절을 통해 흥분성 시냅스 전위를 감소시켰음을 확인하였다. 한편, N-ethylmaleimide (NEM)으로 전처리하면 SYR의 효과가 사라지는 것을 관찰하였다. 또한 SYR이 해마 CA1 신경세포의 칼슘이온 전류를 감소시키며 안정막 전위를 과분극시키는 것을 확인하였다. SYR의 이러한 흥분성 시냅스 전도 억제 작용은 해마 슬라이스에서 피크로톡신으로 유도된 간질 활성을 억제할 수 있었다. 이에 본 연구는 SYR이 시냅스 전 뉴런 말단에 작용하여 흥분성 시냅스 전도를 억제하는 새로운 신경조절물질임을 제시한다. Many neuromodulating drugs acting on the nervous system originate from botanical sources. These plant-derived substances modulate the activity of receptors, ion channels, or transporters in neurons. Their properties make the substances useful for medicine and research. In this study, I found that the plant lignan (+)-syringaresinol (SYR) suppresses excitatory synaptic transmission via presynaptic modulation. Bath application of SYR rapidly reduced the slopes of the field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) at the hippocampal Schaffer collateral (SC)-CA1 synapse in a dose-dependent manner. SYR preferentially affected excitatory synapses, while inhibitory synaptic transmission remained unchanged. SYR had no effect on the conductance or the desensitization of AMPARs but increased the paired-pulse ratios of synaptic responses at short (20-200 ms) inter-stimulus intervals. These presynaptic changes were accompanied by a reduction of the readily releasable pool size. Pretreatment of hippocampal slices with the Gi/o protein inhibitor N-ethylmaleimide (NEM) abolished the effect of SYR on excitatory synaptic transmission, while the application of SYR significantly decreased Ca2+ currents and hyperpolarized the resting membrane potentials of hippocampal neurons. In addition, SYR suppressed picrotoxin-induced epileptiform activity in hippocampal slices. Overall, this study identifies SYR as a new neuromodulating agent and suggests that SYR suppresses excitatory synaptic transmission by modulating presynaptic transmitter release.

뇌혈관계에 미치는 성상신경절차단술의 효과 : The Effect of Stellate Ganglion Block on the Cerebrovascular System

오승택 가천의과학대학교 대학원 2010 국내석사

배경: 성상 신경절 차단이 뇌혈관계 관련 질환들의 치료에 효과적이라는 것은 여러 연구에서 입증이 되었다; 그러나, SGB의 뇌혈관 구조에 어떠한 직접적인 영향을 주는가에 대한 것은 여전히 알지 못한다. 이 연구는 SGB가 뇌혈관계에 어떠한 영향을 주는가에 대해 자기 공명 혈관 조영술을 이용하여 조사해보고자 한다. 방법: 19명의 건강한 여성 자원자들의 TOF (Time of Flight) 혈관 조영술 영상을 SGB 전과 후에 1.5T MRI를 사용하여 얻었다. 성상 신경절 차단은 1% 메피바카인 (Mepivacaine)을 6번째 목뼈의 전측부에 주입을 하여 이루어졌다. 성상 신경절 차단의 성공여부는 ‘호르너 증후군 (Horner`s Syndrome)‘을 나타내는 지에 대한 것으로 판단을 하였다. 우리는 뇌내혈관들(Intracranial Arteries)과 뇌외혈관들(Extracranial Arteries)과 그들의 가지에서 평균 신호크기와 직경의 크기를 측정하여 변화를 관찰하였다. 결과: 성상신경절차단을 통해 SGB를 실시한 곳과 같은 쪽 뇌외혈관들(Extracranial Arteries)에서 신호의 크기가 커진 것을 발견할 수 있었다.; 외경동맥 (11.16%, P<0.001) 과 이 혈관의 하부 혈관들, 예를 들어 후두동맥 (14.09%, P<0.001) 그리고 천측두동맥 (9.55%, P<0.001). 반면에 뇌내동맥들의 신호크기는 신호크기가 증가한 안동맥 (9.97%, P=0.008) 을 제외하고 변화가 없었다. 직경의 변화는 오직 SGB를 실시한 쪽과 같은 쪽 외경동맥에서만 증가하였다 (26.52%, P<0.001). 결론: 우리는 안동맥을 제외한 뇌내동맥들이 변화를 안 받은 것에 비해서 뇌외동맥들에서 특징적인 변화를 관찰할 수 있었다. 이러한 변화가 나타난 데는 아마도 뇌내와 뇌외 혈관들의 조절방식의 차이에 의한 것으로 보인다.