1,2-Dimethylhydrazine에 의한 인체 제대 정맥 내피세포의 비정상적 증식과 유전자 발현 변화 = Expression profiling of 1,2-Dimethylhydrazine stimulated human umbilical vein endothelial cells

국문 초록 (Abstract)

여러 생리 혹은 병리적인 상황에서 혈관의 생성을 아주 중요한 과정이며 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 저자는 혈관 종양과 비정상적인 혈관 증식에 대한 연구가 혈관생성 기전의 연구에 더욱 유리할 것이라 생각하고 체외 모델을 만들고자 하였다.
동물 실험에서 알성 혈관내피종과 혈관육종 등의 혈관 종양을 유발한다고 알려진 DMH를 이용하여 실험실 환경(in vitro)에서 인위적으로 혈관내피세포의 증식을 유도하기 위해 다양한 세포농도와 다양한 DMH 농도 조건에서 인체 제대정맥 내피세포(HUVECs)의 배양 및 증식을 유도하기 위한 실험을 시행하였다. 또한 인위적으로 증식된 혈관내피세포를 이용해 DNA chip 기법으로 유전자 발현 양상을 조사하였다.
실험은 MTT assay를 위한 적정세포수를 결정하여 각 well 당 10^(4)개의 세포를 분주하고 1일간 F12K 완전배지로 배양하고 2일째는 무혈청 배지로 배양한 후 3일째 DMH를 처리하였다. DMH를 첨가하지 않는 세포를 대조군으로 하고 1 mg/㎖부터 1/10씩 회석하여 10^(-3) ng/㎖까지 10가지 농도조건으로 DMH를 처리하여 10종류의 실험군을 설정하였다. 대조군과 각 실험군에서 DMH 처리 후 0, 6, 12, 24, 36, 48, 72시간에 MTT assay로 각 군의 시간대별 OD를 비교 측정하였고, 같은 실험과정을 9회 반복하여 결과를 평균하였다. 자료의 통계적 분석에서 각 군별 0시간의 OD를 기준으로 한 비교는, 10 ng/㎖에서 10^(-3) ng/㎖까지 실험군에서 0시간에 비해 각각 6, 12, 24시간에 유의한 OD의 증가를 보였고 1 ng/㎖에서는 36시간에도 유의하게 증가하였다. 각 시점별 대조군과 실험군간의 비교에서는 10 ng/㎖ 농도 처리군의 6시간과 24시간 OD를 제외하고는 10 ng/㎖에서 10^(-3) ng/㎖ 실험군의 모든 농도와 6-72시간의 모든 시간에서 대조군에 비해 증가를 보였다. MTT asssay의 특성상 대조군에 비해 1.5배 이상의 증가를 보이는 1 ng/㎖의 실험군과 10^(-1) ng/㎖ 실험군이 더욱 의미있는 증가를 보인다고 할 수 있으며, 특히 1 ng/㎖ 실험군은 DMH 처리 후 24시간까지 지속적으로 높은 증가를 보여 이 실험의 목적인 DMH에 의한 혈관 내피세포의 비정상적인 증식의 실험실 모델로 가장 타당할 것으로 판단되었다.
1 ng/㎖의 DMH를 처리하여 증식이 유도된 HUVECs를 DMH 처리 후 12시간 경과의 시점에서 채취하여 RNA를 추출하였고, 이를 대조군의 RNA와 함께 DNA chip 기법을 사용하여 유전자 발현을 분석하였다. 형광물질의 형광강도 차이에 의해 발현된 유전자를 확인할 수 있었고, 보정된 형광강도의 수치를 분석하여 177개의 유전자 발현 양상을 알 수 있었다(발현증가 유전자142개, 발현감소 유전자35개). 발현이 증가 또는 감소된 유전자의 Gene ID로 Gene Bank를 검색하여 개개의 유전자에 대한 정보를 얻었고 이에 따라 분자생물학적 기능과 과정에 따라 유전자를 분석, 분류하였다.
분석된 유전자들 중에서는, 세포 증식과 혈관혈성에 중요한 역할을 하는 VEGF와 FGF의 생성에 관련된 CTGF, EFEMP1, ADPRT, PTX3, CI7, TGFB2, PTTG1, PTPRB, ZNF, 등이 포함되어 있었다. 이를 통해 DMH에 의해 혈관형성과 세포증식에 관여하는 인자로 알려진 분자들의 생성과 관련된 유전자들이 발현되었음을 알 수 있었고, 또한 in vitro에서 DMH를 이용하여 HUVECs의 증식을 인위적으로 유도한 본 연구의 혈관 내피세포 증식 모델이 의미가 있음을 뒷받침해 주었다. 또한, DMH에 의한 MYC, PTTG1, ADPRT 등 종양형성에 관여하는 유전자의 발현이 확인되어 DMH가 종양형성에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다.
저자는 이상의 연구를 통하여 DMH에 의해 비정상적인 혈관 내피세포의 증식을 일으키는 실험실 모델을 개발할 수 있었으며, 이는 유전자 분석을 통해 뒷받침할 수 있었다. 이 결과를 토대로 내피세포 증식과 관련이 있는 유전자만을 선택하여 실제로 정상 내피세포를 형질전환하여 그 세포증식의 조절 여부를 확인하는 실험, 그리고 혈관성 종양에서 시료를 채취하고 특정 유전자를 시발물질(primer)화하여 RT-PCR, Northern blot 등을 통하여 발현 양상을 비교하는 연구 등이 가능할 것이며, 이는 비정상적인 혈관증식의 발생기전에 관한 연구, 더 나아가 혈관형성 과정이나 혈관종양의 발생기전을 밝히고 그 치료법을 찾는데 도움이 될 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The author aimed to perform the experiments that induced proliferation of HUVECs under various concentration of cells and DMH to make endothelial cells proliferate in vitro. This experiment was based on vascular tumors such as malignant hemangioendothelioma and angiosarcoma that are induced by DMH in vivo. The purposes of this study are to establish standard model in which endothelial cell proliferations are induced by DMH stimulation in vitro repetitvely, and to analyze the gene expressions of proliferative HUVECs using DNA chip technique which could evaluate the mechanisms of angiogenesis, neoangiogenesis, and the development of vascular tumors.
To perform the MTT assay in 96-well microplates, 10^(4) cells were seeded in each well which were cultured in F12K full medium on the first day and in serum free medium on the second day. On the third day, the cells were treated with 10 different concentrations of diluted DMH from 1 mg/㎖ to 10^(-3) ng/㎖. 10 DMH-treated groups were compared with the control group which was not treated with DMH. The number of cells in each group was analyzed at time of 0, 6, 12, 24, 36, 48, and 72 hours after DMH treatment. The same experiment was repeated 9 times.
In comparison with optical density of 0 hr in each group, significant cell proliferations were found in all 5 DMH-treated groups of 10 ng/㎖ to 10^(-3) ng/㎖ concentration at the time of 6, 12 and 24 hours, and also in 1 ng/㎖ at 36 hours. Significant increase of cells was observed in 5 DMH-treated groups from 6 to 72 hours compared with control group, except in 10 ng/㎖ DMH-treated groups from 6 to 24 hours. Remarkable proliferation in 1 ng/㎖ group within 24 hours was suggested to be the most meaningful outcome, so then experimental proliferation of HUVECs was established in this condition.
The RNAs were isolated from HUVECs of control group and 1 ng/㎖ DMH-treated group, and they were used to analyze the gene expressions using DNA chip technique. Many genes (177, 142 of up-retulated genes and 35 down-regulated genes) were identified depending on different signal intensity of fluorescencs. The informations about up-regulated or down-regulated genes were assessed by gentic sequence database in Gene Bank. Serveral genes such as CTGF, EFEMP1, ADPRT, PTX3, TGFB2, RTTG1, PTPRB, ZNF were revealed, and they were associated with VEGF and FGF production which play a key role in cell proliferation and angiogenesis. Also DMH could affect expression of genes that involve oncpgenesis, such as MYC, PTTG1, and ADPRT.
In conclusion, DMH might contribute endothelial cell proliferation and angiogenesis as well as oncogenesis. Furthermore, controlling of cell proliferation also could be made by transformation of normal endothelial cell with specific gene that is involved in cell proliferation. After the primers were made by several genes, comparative study of expressed genes about specimen of vascular tumors could be done through RT-PCR and Northern blot. Further study should be performed to evaluate the processes of angiogenesis and morphogensis of vascular tumors, which could be utilized in the development of new therapeutic approaches.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = 1
• 서론 = 2
• 대상 및 방법 = 4
• 결과 = 13
• 고찰 = 39
• 요약 = 51
• 참고문헌 = 54
• Abstract = 63