폴리페놀을 함유한 식물 추출물의 항산화·미백 활성 조절 기전 연구 = A Study on the Mechanisms Regulating the Antioxidant and Anti-Melanogenetic Activities of Plant Extracts Containing Polyphenols

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

A Study on the Mechanisms Regulating the Antioxidant and Anti-Melanogenetic Activities of Plant Extracts Containing Polyphenols Yang Seung Hwa Advisor : Prof. Hyun-Jae Shin, Ph.D. Department of Chemical Engineering, Graduate School of Chosun University Skin aging is a multifactorial biological process driven by cumulative oxidative stress, chronic inflammation, and dysregulated melanogenesis. Among these factors, excessive production of reactive oxygen species （ROS） accelerates cellular damage while simultaneously activating melanogenic signaling pathways, ultimately leading to hyperpigmentation and functional deterioration of the skin. Although numerous naturally derived polyphenols have been reported to exhibit antioxidant and skin-whitening activities, comprehensive mechanistic investigations integrating phytochemical characterization, biochemical evaluation, and intracellular signaling analysis remain limited. Therefore, this study systematically investigated the antioxidant and anti-melanogenetic properties of representative plant-derived polyphenols and their derivatives to clarify the molecular mechanisms responsible for their biological activities. To achieve this objective, structurally diverse bioactive materials were selected, including limonoids isolated from Citrus junos, polyphenol-rich fractions obtained from Castanopsis cuspidata var. sieboldii, a chemically synthesized quercetin derivative （3,7-dioleylquercetin; OQ）, and lignin fractions produced by steam explosion. Their chemical compositions and structural characteristics were comprehensively characterized using chromatographic and spectroscopic techniques, including HPLC-DAD, HPLC-MS/MS, MPLC, NMR spectroscopy, FT-IR spectroscopy, Py-GC/MS, HSQC NMR, and gel permeation chromatography. The biological activities of the isolated compounds and prepared fractions were evaluated through complementary in vitro assays. Antioxidant capacity was determined using radical scavenging assays together with measurements of total polyphenol and flavonoid contents. Anti-melanogenetic activity was assessed by mushroom tyrosinase inhibition, enzyme kinetic analysis, molecular docking simulation, intracellular ROS determination, cellular melanin quantification, and B16F10 melanoma cell-based experiments. Furthermore, Western blotting and RT-PCR analyses were performed to investigate alterations in melanogenesis-related signaling pathways at both protein and transcriptional levels. The investigated compounds consistently exhibited potent antioxidant activities and effectively suppressed melanogenesis through multiple complementary mechanisms. In addition to directly inhibiting tyrosinase activity, they significantly reduced intracellular oxidative stress and melanin accumulation without causing cytotoxicity at biologically active concentrations. Mechanistic analyses demonstrated downregulation of tyrosinase, TRP-1, TRP-2, and MITF expression accompanied by inhibition of the PKA/CREB signaling cascade. Ethyl gallate further modulated the AMPK/AKT/mTOR pathway and autophagy-associated proteins, indicating that regulation of autophagic processes contributes to melanogenesis control. Molecular docking and enzyme kinetic analyses consistently supported the biochemical observations by demonstrating favorable interactions between the investigated compounds and tyrosinase. Collectively, the findings of this study demonstrate that structurally distinct plant-derived polyphenols regulate oxidative stress and melanogenesis through coordinated modulation of enzymatic activity, intracellular redox homeostasis, and multiple signaling pathways. Beyond identifying individual bioactive compounds, this work provides an integrated mechanistic framework explaining how naturally derived polyphenols exert antioxidant and anti-melanogenetic effects at the molecular level. These findings not only expand the current understanding of polyphenol-mediated biological regulation but also provide a scientific foundation for the development of safe and effective natural functional cosmetic ingredients with applications in skin whitening, anti-aging, and oxidative stress management.

목차 (Table of Contents)

• 제1장 서론 1
• 제1절 피부 노화 및 멜라닌 생성 배경 1
• 1. 피부 노화의 개요 1
• 가. 피부의 구조와 기능 1
• 나. 피부 노화의 유형 5
• 다. 피부 노화의 분자적 기전 9
• 2. 멜라닌 생성（Melanogenesis）의 개요 11
• 가. 멜라닌의 종류 및 기능 11
• 나. 멜라닌 생성 과정 14
• 다. 피부 색 형성 메커니즘 18
• 3. 피부 노화와 멜라닌 생성의 상관관계 19
• 가. ROS와 멜라닌 생성의 연관성 19
• 나. 자외선에 의한 색소 침착 22
• 다. 노화에 따른 멜라닌 증가 메커니즘 23
• 4. 멜라닌 생성의 분자적 조절 기전 25
• 가. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 역할 25
• 나. MITF 조절 메커니즘 27
• 다. PKA/CREB 신호전달 경로 27
• 라. MAPK 및 PI3K/AKT 경로 27
• 5. 미백 소재 개발의 필요성 29
• 가. 기존 미백제의 한계 29
• 나. 천연물 기반 미백 소재의 장점 31
• 다. 항산화-미백 통합 전략의 필요성 31
• 제2절 폴리페놀 및 천연 생리활성 물질의 종류와 특성 32
• 1. 폴리페놀의 분류 32
• 가. 페놀산（Phenolic acids） 32
• 나. 플라보노이드（Flavonoids） 33
• 다. 리그닌 및 기타 폴리페놀성 화합물 34
• 2. 시트러스 유래 생리활성 물질: 리모노이드（Limonoids） 36
• 3. 폴리페놀의 주요 생리활성 37
• 가. 항산화 특성 37
• 나. 금속 이온 킬레이션（Metal ion chelation） 37
• 다. 산화환원 조절 기능（Redox regulation） 38
• 제3절 멜라닌 생성 조절 기전 및 천연물의 미백 작용 40
• 1. 멜라닌 생성 조절의 분자적 기전 40
• 가. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 역할 40
• 나. MITF 조절 메커니즘 41
• 다. PKA/CREB 신호전달 경로 42
• 라. MAPK 및 PI3K/Akt 경로 43
• 마. 자가포식（Autophagy）과 멜라닌 생성 조절 44
• 2. 천연물의 미백 작용 기전 47
• 가. Tyrosinase 직접 저해 47
• 나. 멜라닌 생성 관련 단백질 발현 조절 48
• 다. ROS 매개 melanogenesis 억제 49
• 제4절 연구 목적 및 범위 50
• 1. 연구의 필요성 50
• 2. 연구 목표 52
• 3. 연구 범위 및 구성 53
• 제2장 재료 및 방법 56
• 제1절 실험 재료 및 시약 56
• 1. 식물 재료 및 화합물 56
• 2. 항산화 및 효소 활성 분석용 시약 56
• 3. 구조 분석용 시약 및 용매 56
• 4. 세포주 및 세포 배양 시약 57
• 5. 항체（antibody） 57
• 6. 분자생물학 시약 57
• 제2절 천연물 추출 및 분획 방법 58
• 1. 유자（Citrus junos） 종자의 추출 및 분획 58
• 가. 유기용매 추출（리모노이드 아글리콘） 58
• 나. 열수 추출（리모노이드 글루코사이드） 58
• 2. 구실잣밤（Castanopsis cuspidata var. sieboldii） 가지의 추출 및 용매 분획 59
• 3. 퀘르세틴 유도체（3,7-Dioleylquercetin, OQ）의 합성 61
• 4. 대나무（Phyllostachys nigra var. henosis） 줄기의 증기폭쇄 리그닌 추출 및 분획 61
• 제3절 활성 성분 분리 및 구조 분석 63
• 1. HPLC-DAD 및 MPLC를 이용한 노밀린의 분리·정제 및 구조 동정 63
• 2. HPLC-MS/MS를 이용한 에틸 갈레이트（EG） 함유 폴리페놀 분석 64
• 3. NMR을 이용한 OQ （3,7-Dioleylquercetin）의 구조 분석 64
• 4. 분광학 기기를 이용한 대나무 리그닌의 구조 분석 64
• 가. GPC Analysis 64
• 나. FT-IR analysis 65
• 다. Py-GC/MS 65
• 라. NMR spectra 65
• 제4절 생리활성 평가 66
• 1. 항산화 활성 평가 66
• 가. DPPH free radical scavenging activity 66
• 나. ABTS radical scavenging activity 66
• 다. Fe2+ 킬레이션 활성（리그닌 분획） 66
• 라. 총 폴리페놀 함량 측정 66
• 마. 총 플라보노이드 함량 측정 67
• 2. Tyrosinase 저해활성, 효소반응속도론 및 분자도킹 분석 68
• 가. Tyrosinase 저해 활성 평가 68
• 나. 효소 kinetics 분석 68
• 다. 분자 도킹 분석 68
• 3. 세포 실험: 세포 배양, 세포 생존율, 멜라닌 함량, ROS 생성 및 단백질·유전자 발현 분석 70
• 가. 세포 배양 및 세포 생존율 평가 70
• 나. 멜라닌 함량 측정 70
• 다. 세포 내 ROS 생성 측정 70
• 라. Western blot 분석 70
• 마. RT-PCR 분석 71
• 제5절 통계 분석 72
• 제3장 천연물 유래 활성 성분 분리 및 특성 분석 74
• 제1절 유자추출물의 활성 성분 분석 74
• 1. 추출 및 분리 정제 74
• 가. 유자 종자 분리 및 수율 74
• 2. 구조 동정 및 활성 성분 분석 75
• 가. 유자씨 부위별 HPLC 분석 75
• 나. MPLC 분리 정제 78
• 다. NMR 분석 79
• 제2절 구실잣밤추출물의 활성 성분 분석 82
• 1. 추출 및 분리 정제 82
• 가. 구실잣밤 가지 추출물 분획 및 수율 82
• 2. 구조 동정 및 활성 성분 분석 83
• 가. HPLC MS/MS를 이용한 폴리페놀 함량 분석 83
• 제3절 퀴르세틴 유도체 합성 성분 분석 85
• 1. 합성 방법 85
• 2. 구조 동정 및 활성 성분 분석 87
• 가. 퀘르세틴 유도체 MPLC 분리 정제 87
• 나. 퀘르세틴 유도체 NMR 구조 분석 89
• 제4절 대나무 유래 리그닌 분획의 특성 분석 93
• 1. 리그닌 분획 및 분자량 분석 93
• 가. 리그닌 추출 수율 측정 결과 93
• 나. 분자량 측정 결과 95
• 2. 작용기 분석 （FT-IR, Py-GC/MS） 96
• 가. FT-IR analysis 96
• 나. Py-GC/MS analysis 98
• 다. NMR Analysis 102
• 제4장 항산화 및 미백 활성 작용 기전 연구 105
• 제1절 유자추출물의 항산화 및 미백 활성 검증 104
• 1. 유자추출물의 항산화 활성 검증 105
• 가. DPPH 라디칼 소거 활성 105
• 나. 나. ABTS 라디칼 소거 활성 107
• 다. 총 폴리페놀 함량 108
• 2. 유자추출물의 미백 활성 검증 111
• 가. 노밀린의 티로시나제 억제 활성 111
• 나. 효소 동역학 분석 113
• 다. 분자 도킹 연구 115
• 라. 세포독성 평가 및 ROS 정량 분석 117
• 마. 노밀린 처리 B16F10 세포의 멜라닌 함량 및 세포 형태 119
• 바. B16F10 세포에서 노밀린이 항멜라닌 생성 관련 단백질에 미치는 영향 121
• 사. B16F10 세포에서 노밀린이 항멜라닌 생성 관련 유전자에 미치는 영향 124
• 제2절 구실잣밤추출물의 항산화 및 미백 활성 검증 126
• 1. 구실잣밤추출물의 항산화 활성 검증 126
• 가. DPPH 라디칼 소거 활성 126
• 나. ABTS 라디칼 소거 활성 128
• 다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 130
• 2. 구실잣밤추출물의 미백 활성 검증 131
• 가. EG의 Tyrosinase 저해 활성 평가 131
• 나. 티로시나아제의 효소 역학 분석 133
• 다. 분자 도킹 연구 135
• 라. 세포독성 평가 및 세포내 ROS 정량 분석 137
• 마. B16F10 세포에서 EG에 의한 멜라닌 함량 결과 139
• 바. B16F10 세포주에서 EG가 항멜라닌 생성 관련 단백질/유전자 및 자가포식 관련 단백질에 미치는 영향 141
• 제3절 퀴르세틴 유도체의 미백 활성 검증 151
• 1. 퀴르세틴 유도체의 미백 활성 검증 151
• 가. Inhibition Kinetics 151
• 나. 고유 형광 소광 분석 155
• 다. 분자 도킹 연구 157
• 라. 천연 퀘르세틴과 OQ의 세포 생존율 및 멜라닌 함량 159
• 마. B16F10 세포주에서 OQ가 항멜라닌 생성 관련 단백질에 미치는 영향 162
• 바. B16F10 세포에서 OQ가 항멜라닌 생성 관련 유전자에 미치는 영향 166
• 제4절 대나무 유래 리그닌 분획의 항산화 및 미백 활성 검증 168
• 1. 리그닌 분획의 항산화 활성 검증 168
• 가. DPPH free radical scavenging activity 168
• 나. ABTS radical scavenging activity 170
• 다. Total Polyphenol Content 172
• 2. 리그닌 분획의 미백 활성 검증 173
• 가. SEL-F2의 Tyrosinase 저해 동역학 173
• 나. Inhibition of Melanin Synthesis in B16F10 Cell Line 175
• 다. Effect of SEL-F2 on Anti-Melanogenesis-Related Proteins in B16F10 Cells 177
• 제5장 결론 및 제언 182
• 제1절 결론 182
• 제2절 제언 185
• 1. 생리학적으로 고도화된 피부모델을 이용한 기능 검증 185
• 2. 멜라닌 생성 조절 네트워크의 통합적 기전 규명 185
• 3. Multi-omics 기반의 분자기전 해석 및 바이오마커 발굴 186
• 4. 구조-활성 상관관계 기반의 신규 폴리페놀 유도체 개발 186
• 5. 피부 전달기술 및 제형 최적화를 통한 산업적 활용성 확대 186
• 6. 천연물 기반 기능성 소재 발굴 플랫폼의 구축 및 산업화 187
• 참고문헌 189