Phospholipase D1 promotes endocytosis by destabilizing hypoxia-inducible factor -1α = Hypoxia-inducible factor-1α 단백질을 매개로 하는 내포작용에서 Phospholipase D1의 작용기전 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Hypoxia-inducible factor-1? (HIF-1?) is a master regulator that facilitates both oxygen delivery and adaptation to low oxygen by regulation of expression of genes, functioning glucose uptake and metabolism, angiogenesis, erythropoiesis, cell proliferation, and apoptosis. Recently, PLD has been reported to regulate HIF-1? at translation level; however, the other regulations of HIF-1? protein by PLD are not defined. This study shows that HIF-1?-mediated inhibition of endocytosis is reversed by PLD1 via Rab5/7 pathway and PLD1 promotes HIF-1? degradation via the proteasomal pathway. PLD1 and HIF-1? were associated in vivo and in vitro and PLD1 enhanced proline-hydroxylation of HIF-1? by recruitment of PHD2. In addition, PLD1 interacted with VHL and PLD1-mediated hydroxylation of HIF-1? promoted HIF-1? degradation via increasing interaction of HIF-1? and VHL. PLD1 can function as an adaptor protein to promote the degradation of HIF-1?. Moreover, this study showed that downregulation of HIF-1? by PLD1 is oxygen dependent. In conclusion, this study demonstrates that PLD1 is a new regulator of HIF-1? stability and promotes endocytosis via direct interaction with HIF-1?.

국문 초록 (Abstract)

Phospholipase D (PLD)는 인지질 중 포스파티딜콜린을 특이적으로 가수분해하여 콜린과 포스파티드산을 생성하는 효소로서, 현재 PLD1과 PLD2 2가지의 동위효소가 밝혀져 있다. PLD는 효소활성화를 매개로 세포의 생존, 성장, 소낭 이동, 세포골격 재조직화, 수용체 신호전달 및 암화과정 등 세포 생리현상에 중요한 역할을 한다. 최근 들어 PLD의 효소활성을 통해 이루어지는 기능들에 대한 연구뿐 만 아니라 다양한 단백질과의 결합을 통한 다양한 역할에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그럼에도 불구하고 아직 결합단백질로서의 PLD의 역할규명에 관한 연구가 부족한 실정이다.
본 연구는 PLD1가 HIF-1α, VHL 그리고 PHD등 다양한 단백질과의 결합을 통해 EGF의 수용체인 EGFR의 내포작용을 촉진하는 기전을 규명하였다. PLD1은 PHD에 의해 매개되는 HIF-1α의 수산화를 촉진하며 또한 수산화된 HIF-1α와 HIF-1α의 분해단백질인 VHL과의 결합을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 PLD1은 VHL과도 결합하여 HIF-1α 단백질 분해를 촉진한다는 것을 확인하였다.
HIF-1α와 결합하는 PLD1의 부위를 동정한 결과 PLD1-PH에 결합하는 것을 확인하였다. PLD1-PH는 HIF-1α의 단백질 발현을 억제하였고, 이러한 사실을 기반으로 암화과정에 PLD1-PH의 영향성을 알아보고자 HT29세포에 PLD1-PH를 지속적으로 발현케 하는 세포주를 만들어 암생성정도를 확인한 결과 PLD1-PH를 발현하는 경우 암의 생성이 억제되는 것을 알게되었다. 이는 PLD1-PH는 HIF-1α과 결합하여 HIF-1α의 단백질 안정성을 억제하고, 이를 통해 세포의 내포작용이 촉진됨으로서 암화과정 억제효과를 나타낸다는 것을 시사한다.
결론적으로 본 연구는 PLD1이 HIF-1α의 단백질안정성을 조절하는 새로운 조절인자로서 작용한다는 점과 HIF-1α의 결합부위인 PLD1-PH가 암형성의 강력한 억제자로 작용할 수 있다는 점을 제시하고 있다. 따라서 본 연구는 PLD의 새로운 기능에 대한 학문적 이해 증진과 더불어 항암치료의 새로운 표적 제시 및 접근방안에 중요한 정보를 제공하는 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT 1
• I. INTRODUCTION 2
• II. MATERIALS AND METHODS 7
• 1. Materials 7
• 2. Cell culture and transient transfection 7
• 3. Immunoblot and immunoprecipitation 8
• 4. Fluorescence microscopy 9
• 5. RNA isolation and quantitative RT-PCR 9
• 6. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay 10
• 7. PLD activity assay 10
• 8. Pulse and pulse-chase assay 11
• 9. GST pull-down assay 11
• 10. Establishment of transfected HT29 cell line and Xenografts 12
• 11. Statistics 13
• III. RESULTS 14
• 1. HIF-1-mediated inhibition of endocytosis is reversed by PLD1 via Rab5/7 pathway 14
• 2. PLD1 induces HIF-1 degradation 19
• 3. PLD1 interacts with HIF-1 and promotes hydroxylation of HIF-1 by recruitment of PHD2 25
• 4. VHL interacts with PLD1 and is required for PLD1-induced HIF-1 destabilization 33
• 5. PLD1 promotes VHL-HIF-1 interaction 37
• 6. PLD1 plays a critical role in the destabilization of HIF-1 in response to oxygen concentration 42
• 7. PH-domain of PLD1, HIF-1-binding domain of PLD1, promotes HIF-1 destabilization and endocytosis 45
• 8. PH-domain of PLD1 suppresses tumor growth 52
• IV. DISCUSSION 57
• V. REFERENCES 65
• ABSTRACT (In Korean) 70