Butylparaben induces Apoptosis mediated by ER Stress in Primary Cortical Neurons

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Parabens (para-hydroxybenzoic acids) is frequently used as preservatives in food, pharmaceuticals, and cosmetics and is well known as endocrine disruptors to cause neurological disorders similar to other endocrine disruptors. In addition, according to recent studies, severe concerns are raised on the possible link with biological safety of parabens such as neurological disease, breast cancer and reproductive disease about cytotoxicity potential in the human. Due to the association with these diseases, regulations on the use of paraben have been reinforced. However, the molecular mechanisms for the adverse effect of butylparaben on neurological cytotoxicity remain unclear.
In the present study, I investigated that effects of butylparaben on the apoptosis of primary cortical neurons. The neurotoxicity effect of butylparaben were investigated on mice primary cortical neurons by WST-8 and LDH release assay. The result showed that in dose of 500, 1000 µM butylparaben attenuated the neuronal survival in primary cortical neurons. Next, apoptosis was investigated by the TUNEL assay in primary cortical neurons and the analysis suggested that 500 µM butylparaben increased cell death. In addition, I detected to the protein levels of apoptotic-associated in primary cortical neurons using the western blot. I found that 500 µM butylparaben significantly increased pro-apoptotic protein levels of BAX and caspase3, whereas decreasing pro-survival protein levels of Bcl-2 in primary cortical neurons. In prior studies, endoplasmic reticulum stress is one of the mainly factor for inducting apoptosis in primary cortical neurons, and I detected to the protein levels of ER stress-associated using the western blot. I found that 500 µM butylparaben significantly increased ER stress protein levels of GRP78, ATF4 and CHOP in primary cortical neurons. Finally, I demonstrated that apoptosis mediated by ER stress pathway in primary cortical neurons. I treated the ER stress inhibitor, which is inhibition of ATF4 upstream, and I found that apoptosis by butylparaben-induced significantly was inhibited in primary cortical neurons. found that the ER stress was roles in causing the butylparaben-induced apoptosis effects of primary cortical neurons. The results of this study suggest a specific case of neurotoxicity by butylparaben exposure induced apoptosis mediated by ER stress of primary cortical neurons.

국문 초록 (Abstract)

파라벤은 화장품, 식품, 의약품 등 다양한 산업 분야에서 방부제 및 항균제로 사용되는 물질로 내분비계 교란물질로 잘 알려져 있다. 파라벤은 다른 내분비계 교란물질들과 유사하게 신경계 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근 연구결과에 따르면 파라벤은 정신질환, 신경계 질환, 비만, 유방암 등 다양한 질병과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 질병들과의 연관성으로 인해 최근에는 파라벤의 사용에 대한 규제가 강화되고 있다.
본 연구는 대뇌피질 신경세포에서 부틸파라벤에 의한 신경세포의 사멸에 대한 영향을 평가하였다. 부틸파라벤을 대뇌피질 신경세포에 24시간 동안 노출시킨 결과 500 μM 부터 신경세포의 생존율이 감소하고, 세포사멸이 유발됨을 확인하였다. 또한 Bax 및 cleaved-caspase3 같은 세포사멸 관련 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다. 이러한 부틸파라벤에 의한 신경세포의 사멸이 소포체 스트레스를 매개하는지 확인하기 위해 부틸파라벤 처리 후 소포체 스트레스 관련 단백질의 변화를 확인하였다. 그 결과, GRP78 및 ATF4과 같은 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현이 증가하였으며, 결과적으로 세포사멸 관련 단백질의 발현을 유도하는 전사인자인 CHOP의 발현이 증가함을 확인하였다. 이러한 부틸파라벤의 소포체 스트레스를 매개로한 대뇌피질 신경세포 사멸효과를 검증하기위해 소포체 스트레스 억제제인 ISRIB를 처리하였다. 그 결과 부틸파라벤과 ISRIB를 함께 처리한 신경세포는 세포생존율 및 세포사멸이 회복되었고, BAX 및 cleaved-caspase 3 같은 세포사멸 관련 단백질의 발현이 감소함을 확인하였다.
본 연구결과는 부틸파라벤의 노출이 대뇌피질 신경세포의 사멸을 유도하며, 이러한 세포사멸은 소포체 스트레스 경로를 통해 발생한다는 부틸파라벤에 의한 신경독성의 구체적인 사례를 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• II. Materials and Methods 6
• 1. Chemicals and Reagents 6
• 2. Animals and housing conditions 8
• 3. Cell culture and treatment 8
• 4. Western-blotting 9
• 5. WST assay 10
• 6. LDH assay 12
• 7. TUNEL Assay 13
• 8. Statistical analysis 14
• III. Results 16
• 1. Effects of butylparaben on cell survival 16
• 2. Effects of butylparaben on induction of cell death 19
• 3. The regulation of apoptotic protein translation level by butylparaben 22
• 4. The regulation of related ER stress protein expression by butylparaben 25
• 5. Effects of inhibition ER stress on cell survival in butylparaben 28
• 6. Effects of ER stress inhibition on cell death in butylparaben 31
• 7. The effects of ER stress suppression to butylparaben-induced apoptosis 34
• IV. Discussion 39
• V. Reference 44
• 국 문 초 록 58