RANK/RANK신호전달기작을 억제하는 물질 선별

명현호 충남대학교 대학원 2007 국내석사

Bone remodeling은 osteoblasts (조골세포)와 osteoclasts (파골세포)의 상호작용을 통하여 이루어진다. Osteoblasts 또는osteogenic stromal cell에서 발현되는 RANKL(Receptor-activator of NF-kB ligand)는 osteoclast의 RANK(Receptor-activator of NF-kB)에 binding하여, osteoclasts를 분화, 활성화 시킴으로써 bone resorption을 촉진한다. 이 때 RANKL에 binding하여, osteoclasts의 RANK에 RANKL가 binding하는 것을 억제하는 decoy receptor, OPG(osteoprotegerin)가 존재하여 RANKL가 RANK에 적정한 수준으로 binding하게 함으로써 Bone homeostasis를 유지한다. 결과 이러한 bone homeostasis의 중심에 OPG를 포함한 RANK/RANKL signaling pathway가 있다. Osteoblasts와 osteoclasts 활성의 불균형은 분자적인 수준에서 주요하게 RANK/RANKL signaling pathway의 불균형으로 볼 수 있으며, 다양한 종류의 호르몬의 변화와 염증반응을 일으키는 인자와 성장 인자의 변동에 의해 일어날 수 있는데 이것은 결국 골밀도의 감소 (골다공증, osteoporosis) 또는 증가 (골경화증, osteopetrosis)와 같은 뼈의 이상을 야기할 수 있다. 이러한 pathway를 조절할 수 있는 인자를 찾는 다면 의학적으로 중요한 치료 후보 물질이 될 수 있으며, 그에 앞서 그 인자를 찾는 과정을 통하여 bone homeostasis에 대한 더욱 깊은 이해가 가능하리라 본다. 따라서, 본 실험에서는 native 단백질보다 prolonged half-life, 대량 생산(정제)가 용이한 장점이 예상되는 recombinant fusion protein을 만들고, 실제로 native protein과 같은 기능을 수행하는지를 cell-based assay를 통하여 기능을 확인하고 이를 통하여 RANK/RANKL signaling pathway를 in vitro상에서 구현한다. 이렇게 하여 빠른 시간에 대량의 screening이 가능한 시스템을 갖추고 이를 통하여 수없이 많은 signaling을 조절하는 물질들을 screening 하여 main signaling인 RANK와 RANKL의 Receptor-Ligand반응에 대한 이해를 넓히고, 치료적으로 유용할 것으로 예상되는 후보 물질을 선별한다.

Regulation of osteoclast lineage commitment in bone remodeling

유지연 忠南大學校 大學院 2017 국내박사

The Roles of T Cell Death-Associated Gene 51 in Stress Response

박의순 충남대학교 대학원 2013 국내박사

T cell death-associated gene 51 (TDAG51), also known as pleckstrin homology-like domain, family A, member 1 (PHLDA1), was identified in T cell hybridoma mutant resistant to the anti-T cell receptor (TCR)-induced apoptosis. TDAG51 has been shown to mediate Fas expression by protein kinase C (PKC) and T cell apoptosis. Although the role of TDAG51 has been reported mostly as a pro-apoptotic mediator since identification, some reports have demonstrated that TDAG51 has anti-apoptotic function (cell survival). Thus, it remains unclear whether TDAG51 promotes apoptosis or not. In this study, to determine the role of TDAG51 in stress-induced apoptosis, we used TDAG51-knockout (TDAG51-/-) mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Endoplasmic reticulum (ER) stress- and oxidative stress-induced apoptosis were elevated in TDAG51-/- MEFs than in wild-type (TDAG51+/+) MEFs. Cleavage of caspase-3 was more elevated in TDAG51-/- MEFs after ER stress, and level of intracellular reactive oxygen species (ROS) was more elevated in TDAG51-/- MEFs after oxidative stress. These results indicate that TDAG51 is an essential for protection in MEFs during various cellular stress-induced apoptosis, such as ER stress and oxidative stress. The role of TDAG51 is not limited to apoptosis. TDAG51 is expected to play a regulatory role under diverse cellular stress. Some reports demonstrate relationship between TDAG51 and inflammatory response which is one of the cellular stresses. Microarray analysis of parasite-infected macrophage gene expression shows up-regulation of TDAG51 expression. And, lipopolysaccharide (LPS)-induced global gene expression profiling displays up-regulation of TDAG51 expression in immature rat brain. However, direct involvement of TDAG51 in inflammatory response has not been well studied. To analyze the direct role of TDAG51 in inflammatory response, we used TDAG51-/- bone marrow-derived macrophages (BMMs). LPS-induced pro-inflammatory cytokines expression level was decreased in TDAG51-/- BMMs than in TDAG51+/+ BMMs, and its reduced level was restored by TDAG51 expression. Also, TDAG51 interacted directly with Forkhead box protein O1 (FoxO1) transcription factor, and enhanced FoxO1 activity, which is necessary for inflammatory cytokines expression. These data suggest that TDAG51 mediates LPS/Toll-like receptor 4 (TLR4) inflammatory responses via enhancement of FoxO1 activity. Meanwhile, role of TDAG51 is implicated in stress-related brain function. The epilepsy patients have elevated expression of TDAG51 in their anterior temporal neocortex. Gene expression profiling in chronic mild stress (CMS)-exposed mice brain shows elevated expression of TDAG51 in hippocampus and cerebral cortex. But, it is not clear whether TDAG51 is directly involved in stress-related brain functions. To investigate TDAG51 affects stress-related brain function, we carried out behavioral test and brain cDNA microarray analysis in TDAG51-/- mice. TDAG51-/- dams had severe maternal defects after parturition, like a postpartum psychiatric disorder (PPD). TDAG51-/- dams did not take care of their offspring and resulting in newborn offspring quickly died. Also, deficiency of TDAG51 caused dysregulation of diverse endocrine factors, including serotonin, dopamine, hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and oxytocin during postpartum period. These results indicate that TDAG51 is an important for maintenance of maternal behavior via regulation of endocrine factors during stress conditions such as pregnancy and parturition. Taken together, although TDAG51 is still important as mediator in apoptosis, TDAG51 also has crucial role as mediator in cell survival. In addition, TDAG51 shows possible regulatory roles in LPS-TLR4 inflammatory response and PPD pathology. These results suggest that TDAG51 may have various regulatory functions depend on conditions, such as type of cells, tissues and stressors.

TRIP negatively regulates TNF-α-induced osteoclast differentiation

Lee, Jinhee 忠南大學校 大學院 2018 국내석사

Regulation of TDAG51 in TLR4-mediated inflammatory pathway

김주혁 忠南大學校 大學院 2013 국내석사

염증반응(Inflammatory response)이란 생체조직의 손상에 따른 항원의 침입에 대한 국소적인 방어 보호 반응이다. 그 과정을 간략히 설명한다면 조직의 손상에 따라 박테리아와 같은 항원이 침입하게 되면 박테리아로부터 화학물질이 방출된다. 그에 따라 혈관내의 대식세포와 같은 식균성 세포(Phagocyte)가 박테리아를 쫓아 혈관 밖으로 빠져 나오게 된다. 그 후 식균 작용(Phagocytosis)에 의해 박테리아가 제거되고 조직이 치유되게 된다. 이처럼 염증반응은 생체 내 방어를 위한 반응이지만 다양한 만성 질병의 발병 및 진행과 연관이 되어있다는 것이 알려졌다. 선행 연구의 결과로 인해 염증반응에 장기간 노출될 때, 주변 환경 및 생체 내 변화와 같이 영향을 끼쳐서 다양한 난치병의 발병, 진행과 연관이 있다는 것이 밝혀졌기 때문에 염증반응의 발현을 자유롭게 조절할 수 있게 되면 다양한 난치병의 치료에도 도움을 줄 수 있을 거라고 추정할 수 있다. 우선 염증반응은 톨유사수용체(Toll-like receptor, TLR)가 활성화되면서 시작된다고 알려져 있다. 톨유사수용체의 톨(Toll)이란 본래 초파리의 내재성 면역 반응을 담당하는 유전자로 알려져 있으며 쥐나 사람의 유전자에서 비슷한 역할을 하는 유전자를 연구한 결과 톨유사수용체에 대해 알려지게 되었다. 톨유사수용체는 13종류가 존재하며 톨유사수용체 마다 다양한 리간드(Ligand)를 받아들여 면역반응을 일으킨다고 알려졌다. 각 톨유사수용체에 의한 신호경로는 차이를 보이지만 결과적으로 염증성 사이토카인을 활성화시켜 염증반응를 유도한다고 알려졌다. 다양한 톨유사수용체에 의한 염증반응 중에서 톨유사수용체4(TLR4)에 의한 염증반응이 광범위하게 연구되었다. TLR4 염증반응은 그람 음성 박테리아의 외막 표면에 존재하는 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)에 의해 발생하며 리포폴리사카라이드가 톨유사수용체4 표면에 결합을 하면 하위 신호경로를 통해 염증성 사이토카인이 발현되며 그로 인해 염증반응이 발생한다. 한편 TDAG51(T cell death associated 51)은 T 세포 혼성세포주에서 처음 그 존재가 알려져 있으며 T 세포 내에서 세포 자연사가 활성화되는 과정에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이 TDAG51은 다양한 세포에게 스트레스를 주는 환경과 연관이 되있다고 알려져 있으며 Leishmania donovani라는 원생동물을 감염시킨 후 대식세포의 유전자 발현을 확인한 결과 TDAG51이 13배 가까이 증가한 것을 확인했다. 하지만 TDAG51과 톨유사수용체4와의 연관성은 거의 밝혀진 바가 없어서 TDAG51이 톨유사수용체4에 의한 염증반응에 어떤 방식으로 관여하는지에 대한 연구를 수행하게 되었다. 그 결과 톨유사수용체4 신호경로에 의해 TDAG51이 유도된다는 사실과 TDAG51이 발현되는 경로가 TNF receptor associated factor-6(TRAF6)의 하위신호경로를 경유한다는 사실을 알아냈으며, 이렇게 발현된 TDAG51이 톨유사수용체4신호경로 내에서 염증성 사이토카인을 증가시켜 염증반응을 심화시킨다는 사실을 알아냈다. 비록 TDAG51의 프로모터에서 리포폴리사카라이드에 반응하는 위치를 찾는 데에는 실패했지만 TDAG51이 톨유사수용체4에 의한 신호경로 내에서 염증반응을 심화시키는 역할을 수행한다는 것을 발견한 것은 염증반응을 효과적으로 조절할 수 있는 가능성을 보여준 것이라 할 수 있다.

Regulation of RANKL-induced Signaling in Osteoclast Differentiation

유정은 忠南大學校 大學院 2014 국내박사

Bone homeostasis is regulated by balanced actions of bone-forming osteoblasts and bone-resorbing osteoclasts. Osteoclasts are derived from monocyte/macrophage lineage precursors in bone marrow through a process of cellular differentiation that is induced by receptor activator of nuclear factor kappa B (NF-κB) ligand (RANKL) signaling. Osteoclasts are multinucleated giant cells that have unique morphological characteristics allowing them to resorb bone matrix. Accelerated bone destruction by osteoclasts might cause several metabolic bone-related diseases, such as osteoporosis and inflammatory bone loss. Therefore, the regulation of osteoclast differentiation and activation is the main therapeutic target for bone diseases. Here, I report the regulation of RANKL-induced signaling in osteoclast differentiation by a novel negative-feedback regulator or a chemical inhibitor. In the present study, WD40-repeat-containing protein 23 (WDR23) was identified to be a novel negative-feedback regulator of RANKL-induced osteoclastogenesis. Tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor 6 (TRAF6) is an early adaptor protein essential for RANKL signaling. TRAF6-deficient mice exhibit a severe osteopetrotic phenotype and are defective in osteoclast formation. Because of the essential role of TRAF6 in osteoclastogenesis, TRAF6 can be the target of negative regulator to prevent excessive osteoclast differentiation. In this study, WDR23 was identified as a TRAF6-binding partner. The protein stability of TRAF6 was reduced by WDR23 through autophagy-mediated degradation system. In particular, WDR23 played the negative role in TRAF6-mediated RANKL signaling for osteoclast differentiation. WDR23 expression was induced by RANKL during osteoclastogenesis. The overexpression of WDR23 in bone marrow-derived macrophages (BMMs) inhibited the osteoclast formation. Next, it was showed that the reduction of TRAF6 protein stability causes the inhibition of RANKL-induced signal activation in WDR23-overexpressing BMMs. Consequently, the induction of NFATc1 was down-regulated in osteoclasts derived from WDR23-overexpressing BMMs, leading to inhibition of the gene expression for osteoclast specific markers. Moreover, the effects of WDR23 on TRAF6-mediated RANKL signaling was confirmed using WDR23 knockdown BMMs. Thus, these findings suggest that WDR23 is a critical for the regulation of osteoclastogenesis by modulating TRAF6 and might have an important role for proper bone remodeling. Secondly, it was showed that D-chiro-inositol negatively regulates RANKL-induced osteoclastogenesis by down-regulating NFATc1. D-Pinitol (3-O-methyl-D-chiro-inositol) is a prominent component of dietary legumes and is actively converted to D-chiro-inositol, which is a putative insulin-like mediator. In addition, D-pinitol/D-chiro-inositol has recently shown the potential as an anti-inflammatory agent by inhibiting NF-κB signaling or proinflammatory cytokine expression. However, the cellular and molecular targets of D-pinitol/D-chiro-inositol remain poorly understood. In this study, the effect of D-chiro-inositol on osteoclast differentiation was analyzed. It was demonstrated that D-chiro-inositol acts as an inhibitor of RANKL-induced osteoclastogenesis. The formation of multinucleated osteoclasts by cell–cell fusion was reduced by the treatment with D-chiro-inositol in a dose-dependent manner. The activation of NF-κB, p38 and JNK pathways downstream of RANKL signaling was inhibited by the treatment with D-chiro-inositol. Finally, it was demonstrated that D-chiro-inositol inhibits the expression of several osteoclastogenic genes by down-regulating NFATc1. Hence, these results show that D-chiro-inositol might be a good candidate to treat inflammatory bone-related diseases or secondary osteoporosis in diabetes mellitus. Taken all together, these two studies provide a new insight into the regulation of RANKL-induced signaling in osteoclast differentiation and show a potential as therapeutic candidates for bone-related diseases.

Butylparaben induces Apoptosis mediated by ER Stress in Primary Cortical Neurons

고문이 忠南大學校 大學院 2022 국내석사

Parabens (para-hydroxybenzoic acids) is frequently used as preservatives in food, pharmaceuticals, and cosmetics and is well known as endocrine disruptors to cause neurological disorders similar to other endocrine disruptors. In addition, according to recent studies, severe concerns are raised on the possible link with biological safety of parabens such as neurological disease, breast cancer and reproductive disease about cytotoxicity potential in the human. Due to the association with these diseases, regulations on the use of paraben have been reinforced. However, the molecular mechanisms for the adverse effect of butylparaben on neurological cytotoxicity remain unclear. In the present study, I investigated that effects of butylparaben on the apoptosis of primary cortical neurons. The neurotoxicity effect of butylparaben were investigated on mice primary cortical neurons by WST-8 and LDH release assay. The result showed that in dose of 500, 1000 µM butylparaben attenuated the neuronal survival in primary cortical neurons. Next, apoptosis was investigated by the TUNEL assay in primary cortical neurons and the analysis suggested that 500 µM butylparaben increased cell death. In addition, I detected to the protein levels of apoptotic-associated in primary cortical neurons using the western blot. I found that 500 µM butylparaben significantly increased pro-apoptotic protein levels of BAX and caspase3, whereas decreasing pro-survival protein levels of Bcl-2 in primary cortical neurons. In prior studies, endoplasmic reticulum stress is one of the mainly factor for inducting apoptosis in primary cortical neurons, and I detected to the protein levels of ER stress-associated using the western blot. I found that 500 µM butylparaben significantly increased ER stress protein levels of GRP78, ATF4 and CHOP in primary cortical neurons. Finally, I demonstrated that apoptosis mediated by ER stress pathway in primary cortical neurons. I treated the ER stress inhibitor, which is inhibition of ATF4 upstream, and I found that apoptosis by butylparaben-induced significantly was inhibited in primary cortical neurons. found that the ER stress was roles in causing the butylparaben-induced apoptosis effects of primary cortical neurons. The results of this study suggest a specific case of neurotoxicity by butylparaben exposure induced apoptosis mediated by ER stress of primary cortical neurons. 파라벤은 화장품, 식품, 의약품 등 다양한 산업 분야에서 방부제 및 항균제로 사용되는 물질로 내분비계 교란물질로 잘 알려져 있다. 파라벤은 다른 내분비계 교란물질들과 유사하게 신경계 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근 연구결과에 따르면 파라벤은 정신질환, 신경계 질환, 비만, 유방암 등 다양한 질병과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 질병들과의 연관성으로 인해 최근에는 파라벤의 사용에 대한 규제가 강화되고 있다. 본 연구는 대뇌피질 신경세포에서 부틸파라벤에 의한 신경세포의 사멸에 대한 영향을 평가하였다. 부틸파라벤을 대뇌피질 신경세포에 24시간 동안 노출시킨 결과 500 μM 부터 신경세포의 생존율이 감소하고, 세포사멸이 유발됨을 확인하였다. 또한 Bax 및 cleaved-caspase3 같은 세포사멸 관련 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다. 이러한 부틸파라벤에 의한 신경세포의 사멸이 소포체 스트레스를 매개하는지 확인하기 위해 부틸파라벤 처리 후 소포체 스트레스 관련 단백질의 변화를 확인하였다. 그 결과, GRP78 및 ATF4과 같은 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현이 증가하였으며, 결과적으로 세포사멸 관련 단백질의 발현을 유도하는 전사인자인 CHOP의 발현이 증가함을 확인하였다. 이러한 부틸파라벤의 소포체 스트레스를 매개로한 대뇌피질 신경세포 사멸효과를 검증하기위해 소포체 스트레스 억제제인 ISRIB를 처리하였다. 그 결과 부틸파라벤과 ISRIB를 함께 처리한 신경세포는 세포생존율 및 세포사멸이 회복되었고, BAX 및 cleaved-caspase 3 같은 세포사멸 관련 단백질의 발현이 감소함을 확인하였다. 본 연구결과는 부틸파라벤의 노출이 대뇌피질 신경세포의 사멸을 유도하며, 이러한 세포사멸은 소포체 스트레스 경로를 통해 발생한다는 부틸파라벤에 의한 신경독성의 구체적인 사례를 제시한다.

Role of TRAF interacting protein in TNF-R Signaling Pathway

최승아 충남대학교 대학원 2013 국내박사

TNF-receptor-associated factor 2 (TRAF2) is a key adaptor molecule in TNF-R signaling complexes that promotes the activation of transcription factor such as NF-kappaB. Previous studies demonstrated that K63-ubiquitination of TRAF2 contributes to recruitment of TAB/TAK1 complex. It leads to activation of NF-kappaB. TRAF2-ubiquitination is dependent on the E3 ligase activity of TRAF2 RING domain. Recent study showed that sphingosine-1-phosphate (S1P), is phosphorylated by sphingosine kinase 1(SPHK1), is an essential cofactor for TRAF2 ubiquitin ligase activity. S1P is important for the activation of TRAF2- ubiquitin ligase, enabling it to mediate the activation of NF-kappaB in TNFR1 signaling. However, a regulator of the mechanism remains largely unknown. One of the known binding partners of the TRAF2, TRAF-interacting protein (TRIP), contains a RING finger motif, rod-like coiled coil domain and leucine zipper domain in its amino-terminal region. In this study, I reported that TRIP reduces Ubc13-dependent K63-linked ubiquitination of TRAF2. Moreover, rod-like coiled coil domain of TRIP is essential for inhibition of TRAF2 ubiquitination and NF-kappaB activity. In addition, I identified that TRIP associates with TRAF2-SPHK1 complex and suppresses NF-kappaB activation induced by TRAF2-SPHK1 complex. TRIP also inhibits binding of S1P to TRAF2. Consistently, overexpression of TRIP suppresses production of TNF-alpha-induced pro-inflammatory cytokines. Indeed, knockdown of TRIP promotes TNF-alpha-induced pro-inflammatory cytokine. Recently, it has been found that osteoclast differentiation is induced by TNF-alpha. Here, I found that TRIP as a key regulator of osteoclastogenesis that plays a role in suppressing TNF-alpha-induced osteoclast differentiation. Furthermore, TRIP depletion promotes TNF-alpha-induced osteoclastogenesis. These results suggest that TRIP is critical for suppression of TNF-alpha-induced osteoclast formation. In conclusion, these findings demonstrate that TRIP plays a regulator in TNF-R signaling. Therefore, I suggest that TRIP is a potential therapeutic target of inflammatory responses. TNF-R 신호전달기작에서 중요한 adaptor로서 알려진 TRAF2 단백질은 NF-kappaB를 포함하는 전사인자의 활성을 조절한다. 기존의 논문에 의하면, TRAF2 단백질의 K63-ubiquitination은 TAB/TAK1 complex와의 상호결합을 유도하여 NF-kappaB 활성기작을 촉진시킨다. TRAF2 단백질의 ubiquitination은 TRAF2 단백질의 RING finger motif에 존재하는 E3 ubiquitin ligase 활성에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 최근 연구결과를 통해, sphingosine-1-phosphate (S1P)가 TRAF2 단백질의 E3 ubiquitin ligase의 cofactor로 작용함이 밝혀졌다. S1P는 sphingosine kinase 1 (SPHK1)에 의해 인산화되며, TNF-R 신호전달기작내에 존재하는 NF-kappaB 활성기작 조절을 매개하는 TRAF2 단백질의 ubiquitin ligase의 활성을 조절하는데 중요한 영향을 미친다. 그러나 이러한 S1P를 통한 TRAF2 단백질의 ubiquitin ligase의 활성을 억제하는 단백질에 대해서는 아직 충분한 연구가 이루어지지 않았다. TRAF2 단백질과 상호결합을 하는 것으로 밝혀진 TRIP 단백질은 amino-말단 부위에 RING finger motif, rod-like coiled coil domain, leucine zipper domain 으로 구성되어있다. 본 연구에서는 이러한 TRIP이 TRAF2 단백질의 K63-ubiquitination을 억제하는 조절자로서 작용한다는 사실을 밝혔다. 또한, TRAF2 단백질의 ubiquitination 을 억제하는 TRIP의 조절기작에서 rod-like coiled coil domain 부위가 중요하게 작용하는 것으로 보인다. 본 연구는 TRIP이 TRAF2-SPHK1 complex와 결합하여 TRAF2-SPHK1 complex에 의해 매개되는 NF-kappaB 활성을 억제하는 사실과 TRIP이 S1P와 TRAF2간의 상호결합을 억제함을 추가로 밝혀내었다. 이처럼, TRIP은 S1P와 TRAF2의 상호결합을 억제함으로써 TRAF2의 ubiquitination을 억제하고 TRAF2에 의해 유도되는 NF-kappaB 활성기작을 조절하는 조절자 역할을 하는 것으로 여겨진다. 본 연구를 통해, 세포수준에서 TRIP 단백질의 과발현이 TNF-alpha에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 생성을 억제하며, TRIP의 결핍은 TNF-alpha에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 생성을 촉진한다는 사실을 확인하였다. 세포 내에서 TRIP은 NF-kappaB 활성 기작을 조절하여 NF-kappaB에 의해 유도되는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것으로 보인다. 본?두번째?연구에서는?TRIP 단백질이 TNF-alpha에 의해 유도되는 파골 세포의 분화에 영향을 미친다는 사실을 밝혔다. 최근 연구에 따르면 TNF-alpha가?파골?세포의?분화에도?중요한 영향을?미친다는?사실이?보고되었다. 본?연구를?통해?TRIP이 과발현 되었을 때 TNF-alpha에 의한 파골 세포의 분화가 억제되는 사실과 TRIP이 결핍되었을 때는 TNF-alpha에 의한 파골 세포의 분화가 촉진되는 현상을 확인하였다. 본 연구를 통하여, TRIP 단백질이 새로운 TNF-R 염증성 신호전달기작의 조절자임을 규명하였으며 이러한 TRIP의 역할은 염증성 질환의 치료 개발까지 확대 적용할 수 있을 것으로 사료된다.

WDR23-TRAF6 interaction reduces the stability of TRAF6

윤혜연 忠南大學校 大學院 2016 국내석사

우리 몸을 이루고 있는 뼈는 골 항상성(Bone homeostasis)을 유지하며 평생 동안 재구성이 이루어진다. 골 항상성은 뼈를 파괴하는 세포인 파골세포(osteoclast)와 뼈를 생성하는 세포인 조골세포(osteoblast)의 균형잡힌 상호작용을 통해 조절된다. 이 과정에서 파골세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)로부터 분화하여 여러 개의 핵을 가진 거대세포로 형성된다. 파골세포의 분화과정에는 RANK(Receptor activator of nuclear factor kappa B)와 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)의 결합에 의한 신호전달과정이 가장 중요하다고 알려져 있다. RANK/RANKL의 신호전달작용에는 세포 내에서 매개 단백질로 알려진 TRAF6(Tumor necrosis factor receptor associated factor 6)에 의해 신호가 전달됨으로써 파골세포의 분화에 필요한 유전자들이 발현된다. TRAF6 유전자가 결핍된 생쥐에서 골경화증이 나타남으로써 TRAF6가 파골세포의 분화에서 중요한 역할을 하는 단백질이라는 것이 확인되었다. 선행연구에서 TRAF6와 상호작용을 하는 단백질을 선별하여 그 중에서도 WDR23(WD40-repeat-containing protein 23)이라는 단백질을 찾아내었다. 선행연구에서 WDR23이 TRAF6와 직접적으로 결합할 뿐만 아니라 WDR23에 의해 TRAF6의 단백질 양이 줄어드는 현상을 밝혀내었다. 단백질의 분해과정에는 유비퀴틴(Ubiquitin)에 의한 프로테아좀(Proteasome) 분해과정과 자식작용(Autophagy) 두 가지 과정이 알려져 있는데 선행연구결과 WDR23에 의한 TRAF6의 분해가 유비퀴틴(Ubiquitin)에 의한 프로테아좀(Proteasome) 분해과정과 관련이 없는 것을 확인하였다. 그리고 파골세포의 분화과정에서 WDR23이 어떠한 작용을 하는지 연구되었는데 먼저 WDR23이 과발현(Overexpression)되었을 때는 파골세포의 분화가 감소하는 것을 확인하였다. 또, WDR23의 발현을 억제(Knockdown)하였을 때는 파골세포의 분화가 증가하는 현상을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 WDR23에 의한 TRAF6의 감소하는 현상이 유비퀴틴에 의한 프로테아좀 분해과정이 아닌 자식작용에 의한 현상이라는 것을 확인하였다. 그리고 WDR23이 과발현되었을 때 자식작용의 전체과정이 촉진되는 것이 아니라 WDR23이 TRAF6를 자식작용과정에서 형성되는 리소좀(lysosome)에 보내주는 역할을 하는 것으로 생각되는 결과를 확인하였다. 또한 RANK와 TRAF6 그리고 WDR23이 복합체를 형성하는 것을 확인하여 WDR23이 파골세포의 분화를 조절하는데 TRAF6뿐만 아니라 RANK에도 영향을 줄 수 있는 가능성을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통해 WDR23이 TRAF6의 단백질 양을 자식작용을 통해 감소시키는 것을 확인할 수 있었고, 파골세포의 분화를 음성적으로 조절함으로써 골 항상성에 중요한 역할을 수행할 수 있는 가능성을 확인하였다.

DNAJB14 positively regulates RANKL-induced osteoclastogenesis

김수미 忠南大學校 大學院 2016 국내석사

생체의 골격 (Bone)내를 구성하는 세포 뿐 만 아니라 혈액 속의 세포가 만들어지는 과정을 조혈작용 (Hematopoiesis)이라 한다. 조혈작용은 골수 (Bone marrow)에 존재하는 조혈모세포 (Hematopoietic stem cell)로부터 시작된다. 다분화능 (multipotent)인 조혈모세포는 혈구 (myeloid)와 림프구 (lymphoid)인 두 가지 경로를 거쳐 분화한다. 혈구전구세포 (myeloid progenitor cell)는 거핵구 (megakaryote), 적혈구 (erythrocyte), 수지상세포 (dendritic cell), 호염기성세포 (basophil), 호중성구 (neutrophil), 호산구 (eosinophil), 단핵구 (monocyte), 대식세포 (macrophage), 파골세포 (osteoclast) 등으로 분화한다. 반면에, 림프전구세포 (lymphoid progenitor cell)는 B 세포 (B lymphocyte), T 세포 (T lymphocyte), 내추럴 킬러 세포 (natural killer cell) 등으로 분화한다. 선행 연구에 의하여 혈구 세포 계열인 파골세포, 대식세포, 수지상세포의 유전자 내 발현 프로파일 (gene expression profile)이 cDNA microarray를 통하여 분석되었고, 파골세포 분화 (differentiation) 과정 중 특이적으로 발현하는 후보군인 DNAJB14 유전자를 선발 (screening)하였다. DNAJB14은 3개의 domain (J domain, Glycine/phenylalanine rich domain, transmembrane domain)을 가지고 있는 소포체 (endoplasmic reticulum)에 존재하는 막단백질 (membrane protein)이다. DNAJB14은 소포체에서 샤페론 (chaperone)과 함께 비접힘 단백질 (unfolded, misfolded protein)을 조절하는 co-chaperone으로서의 역할이 알려져 있으나 파골세포 내에서의 역할과 정확한 메커니즘이 보고된 바 없어, 이에 관련된 연구를 수행하였다. 파골세포의 분화에 필수요소인 RANKL를 처리하고 그 때, DNAJB14이 과발현 (overexpression)되었을 때 또는 knock-down 되었을 때 파골세포의 분화 정도와 파골세포 분화의 마스터 분자 (master molecule)인 NFATc1을 비롯하여 cathepsinK, DC-STRAMP, TRAP, OSCAR 등 파골세포 특이적인 유전자의 발현을 확인함으로써 DNAJB14 유전자가 파골세포 분화 과정 중에 수행하는 역할을 확인하였다. 또한 DNAJB14의 deletion mutant를 제작하여 DNAJB14의 J domain이 이러한 역할을 수행한다는 것을 확인하였다. 이러한 발견은 DNAJB14가 소포체에서 co-chaperone 으로 역할을 할 뿐만 아니라 파골세포의 분화에도 영향을 미치고 있고, 이러한 영향은 DNAJB14의 J domain을 통하여 이루어지고 있음을 첫 번째로 보여주는 연구성과라고 할 수 있다.