LPS로 급성염증 유도된 RAW 264.7 대식세포와 마우스 모델에 대한 초오약침의 항염증 효과 = Anti-inflammatory Effects of Aconitum ciliare Decaisne Pharmacopuncture on LPS-induced Acute Inflammation in RAW 264.7 Macrophages and Mouse Models

국문 초록 (Abstract)

LPS로 급성염증 유도된 RAW 264.7 대식세포와 마우스 모델에 대한 초오약침의 항염증 효과 선 윤 권 동신대학교 대학원 한의학과 (지도교수 김재홍) 목적 본 연구에서는 초오약침의 급성 염증에 대한 항염증 효과 및 발현 기전을 알아보 기 위해 In-vivo 및 In-vitro 환경에서 연구를 수행하였다. 방법 본 연구에서의 In-vitro 실험에서 초오약침을 처리한 대식세포 RAW264.7 세포에 LPS로 염증반응을 유도하여 세포의 NO, PGE2, Cytokine 생성량을 측정하였다. iN OS, COX-2, Cytokine의 세포 내 유전자 및 단백질 발현량을 측정하였으며 ERK, J NK, p38의 단백질 인산화를 측정하였다. In-vivo 실험에서는 아무것도 처치하지 않는 정상군(n=6)과 LPS를 투여한 후 아 무런 처치를 하지 않은 대조군(n=6), ADP를 5, 10㎖/kg로 투여하는 ADP 1, 2군 (각 n=6) 총 4개의 그룹으로 나누어 ADP를 투여하는 실험군은 각각 체중에 맞 게 계산된 양을 복강 내로 매일 1회, 오후 2시에 주사하였다. 정상군을 제외한 모든 실험동물의 염증반응 유도를 위해 LPS 1㎎/㎏을 복강에 주사하였다. 3시간 뒤에 3% isoflurane을 사용하여 마취하여 심장 천자법으로 채혈하였다. 이후, 채혈한 혈 액을 EDTA tube와 microcentrifuge tube로 분류하여 보관하였다. EDTA tube에 담긴 혈액은 바로 면역세포 수를 분석하였고 microcentrifuge tube의 혈액은 30분간 실온에서 굳혀 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후에 혈청을 획득하였다. 혈액을 채 취한 후 비장조직을 분리하였고 모든 검체는 초저온 냉동고(-80℃)에 보관하면서 분석에 사용하였다. 면역세포, NO, PGE2, Cytokine의 유전자 발현량·단백질 발현량· 생성량을 측정하였다. 결과 In-vitro 실험에서 ADP는 세포 내 NO 및 PGE2 생성량을 농도 의존적으로 유의 하게 감소시켰다. 특히, NO 생성은 5% 이상의 ADP에서 유의하게 감소하였다. 세 포 내 IL-1β, IL-6, TNF-α 생성량도 5% 이상의 ADP에서 농도 의존적으로 유의하 게 감소하였으며, IL-1β의 경우 10%의 ADP에서 유의한 감소가 나타났다. 세포 내 iNOS, COX-2 및 Cytokine(IL-1β, IL-6, TNF-α) 유전자 발현량은 농도 의존적으 로 유의하게 감소하였다. 특히, iNOS와 COX-2 유전자 발현량은 5% 이상의 ADP 에서 유의하게 줄어들었다. 세포 내 iNOS, COX-2, IL-6, TNF-α 단백질 발현량은 의농도 존적으로 유의하게 감소하였으며, IL-1β의 단백질 발현량은 10%의 ADP에 서 유의하게 감소하였다. ERK 단백질의 인산화는 유의한 변화가 나타나지 않았지 만, p38 단백질의 인산화는 5%의 ADP에서, JNK 단백질의 인산화는 10%의 ADP 에서 유의하게 감소하였다. In-vivo 실험에서 ADP는 면역세포 수를 변화시켰다. 백혈구와 단핵구 수는 ADP 1, 2군에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하였으며, 호중구, 호산구, 림프구 수는 ADP 2군에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 호염기구는 유의한 변화가 나타 나지 않았다. 혈청 내 PGE2 및 Cytokine(IL-1β, IL-6, TNF-α) 생성량은 ADP 1, 2 군에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다. 비장조직 내 iNOS, C OX-2, IL-1β 유전자 발현량은 ADP 1, 2군에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하 였으며, TNF-α 유전자 발현량은 ADP 2군에서 유의하게 감소하였다. iNOS, COX- 2, IL-1β, IL-6, TNF-α 단백질 발현량은 ADP 1, 2군에서 농도 의존적으로 유의하 게 감소하였다. 단백질 인산화에서는 ERK 단백질과 p38 단백질의 인산화가 ADP 2 군에서 유의하게 감소하였고, JNK 단백질의 인산화는 ADP 1, 2군에서 농도 의존적 으로 유의하게 감소하였다. 결론 이러한 결과는 초오약침이 LPS로 급성염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포와 ICR 마우스 모델에서 항염증 효과가 있음을 나타낸다. Keywords: Aconitum ciliare Decaisne, Anti-inflammatory effect, Pharmacopunctu re, LPS

목차 (Table of Contents)

• Tablesⅴ
• Figures ⅷ
• 초록 ⅺ
• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 3
• 1. 재료 3
• 1) 시료 3
• 2) 시약 3
• 3) 장비 4
• 2. 방법 4
• 1) 세포 배양 4
• 2) 세포 생존율 측정 5
• 3) 세포 검체 준비5
• 4) 실험동물5
• 5) 군 설정 5
• 6) 혈액 및 조직 검체 준비 6
• 7) 면역세포 분석 6
• 8) NO 생성량 측정 6
• 9) Cytokine 생성량 측정6
• 10) PGE2 생성량 측정 7
• 11) 유전자 발현량 측정 7
• 12) 단백질 발현량 측정 8
• 3. 통계처리 8
• Ⅲ. In-vitro 실험 결과 10
• 1. 세포 생존율10
• 2. 세포 내 NO 생성량11
• 3. 세포 내 PGE2 생성량12
• 4. 세포 내 Cytokine 생성량 13
• 1) IL-1β 13
• 2) IL-6 14
• 3) TNF-α 15
• 5. 세포 내 유전자 발현량 16
• 1) iNOS 16
• 2) COX-2 17
• 3) IL-1β 18
• 4) IL-6 19
• 5) TNF-α 20
• 6. 세포 내 단백질 발현량 21
• 1) iNOS 21
• 2) COX-2 22
• 3) IL-1β 23
• 4) IL-6 24
• 5) TNF-α 25
• 7. 세포 내 단백질 인산화 26
• 1) ERK26
• 2) JNK27
• 3) p3828
• Ⅳ. In-vivo 실험 결과 29
• 1. 면역세포 수29
• 1) 백혈구 29
• 2) 호중구 30
• 3) 호산구 31
• 4) 호염기구 32
• 5) 림프구 33
• 6) 단핵구 34
• 2. 혈청 내 PGE2 생성량35
• 3. 혈청 내 Cytokine 생성량 36
• 1) IL-1β 36
• 2) IL-637
• 3) TNF-α 38
• 4. 비장조직 내 유전자 발현량 39
• 1) iNOS 39
• 2) COX-2 40
• 3) IL-1β 41
• 4) IL-6 42
• 5) TNF-α 43
• 5. 비장조직 내 단백질 발현량 44
• 1) iNOS 44
• 2) COX-2 45
• 3) IL-1β 46
• 4) IL-6 47
• 6) TNF-α 48
• 6. 비장조직 내 단백질 인산화 49
• 1) ERK49
• 2) JNK 50
• 3) p3851
• Ⅳ. 고찰52
• Ⅴ. 결론58
• Reference60
• ABSTRACT 66