Anti-cancer stemness effect of β-carotene and β, β-carotene 15-15' monooxygenase in human neuroblastoma cells : implication for receptor related molecular mechanism and tumor metastasis = 신경모세포종에서 베타카로틴과 케타카로틴 대사효소의 항암줄기세포 효능 : 수용체 매개 분자기전 및 항전이 효능에 관하여

국문 초록 (Abstract)

신경모세포종은 1세미만의 영유아에게 발병하는 소아암으로써, 신경으로 분화 이전의 미성숙한 신경모세포에서 유래하며, 일부는 암줄기세포적 특징을 지닌다. 암줄기세포는 자가복제, 종양형성, 분화를 할 수 있는 능력을 가지며, 이는 예후가 좋지 않으므로 암줄기세포를 표적하여 신경모세포종의 효율적인 치료기전을 규명하는 일은 중요하다.
DLK1은 신경모세포종의 암줄기세포적 성격을 대표하는 유전자로써, 신경모세포종에서 DLK1의 발현은 종양의 악성 정도 및 미분화정도와 비례하여 발현하는 것으로 알려져 있다.
베타카로틴은 카로티노이드의 일종으로, 녹황색 과일과 채소에 풍부하게 함유된 대표적인 비타민A의 전구체이며, 식품을 통해 영양소로써 공급된다. 베타카로틴은 체내 장세포에서 BCO1 효소를 통해 두 분자의 레틴알데하이드로 전환되며 이는 레티노익산(RA)으로 대사된다.
RA는 수용체인 RA수용체(RAR)에 결합하여 핵 안에서 유전자의 발현을 조절한다. 현재까지 베타카로틴이 가지는 항산화 및 항암효능이 일부 알려진바 있으나, RAR과의 연관성 및 분자적 기전 규명은 제한적이다. 또한 베타카로틴의 대사 기능과 독립적으로, BCO1이 신경모세포종의 항암줄기세포 및 항전이에 미치는 효능과 기전은 현재까지 연구된 바 없다.
이를 규명하기 위하여 베타카로틴의 처리에 따른 DLK1 및 RARs 발현을 측정하고, DLK1 유전자 내 RARβ의 예상 결합 부위를 예측한 후, ChIP assay로 RARβ이 DLK1에 직접 결합함을 규명하였다. RARβ 발현을 억제하였을 때 암세포의 자가복제 능력이 증가함을 확인함으로써, RARβ이 베타카로틴에 의한 신경모세포종의 항암효능에 관여함을 규명하였다. BCO1의 항암줄기세포 및 항전이 효능을 규명하기 위하여, BCO1을 발현하는 세포주를 제작하여 암줄기세포 마커 및 전이와 관련된 matrix metalloproteinases (MMPs) 마커의 발현을 qRT-PCR과 western blot을 통해 측정하였다. 저산소 환경에서 암의 줄기세포적 성격 강화에 관여하는 hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) 및 관련 유전자들을 측정하였다. Colony와 sphere 형성을 통해 자가복제에 미치는 영향 및 세포의 이동성과 침투성에 BCO1이 미치는 영향을 규명하기 위해 migration assay, invasion assay 실험법이 수행되었다. 또한 전이마우스 모델을 이용해 BCO1이 전이의 발생률에 미치는 영향을 규명하고, 전이된 간조직에서 암줄기세포마커 및 전이 관련 마커의 발현에 미치는 영향을 qRT-PCR 및 western blot을 통해 측정하였다. BCO1의 항암효능의 기전을 규명하기 위해 miRNAs 시퀀싱 분석을 통해 miRNAs 발현을 비교하였다.
그 결과, 베타카로틴이 신경모세포종의 대표적인 암줄기세포 유전자인 DLK1와 자가복제 능력을 억제하는 과정에서, RARs의 세가지 형태 가운데 RARβ가 중요한 기능을 함을 규명하였다. 특히 이는 DLK1의 전사를 조절하는 구간에 포함된 RARE (RA response element)에 RARβ가 직접 결합함으로써 조절되는 기전임을 규명하였다.
또한, 본 연구에서는 BCO1의 항암줄기세포 및 항전이 효능을 규명하였다. BCO1을 발현하는 신경모세포종에서 암줄기세포 마커의 억제 및 자가복제 억제를 확인하였다. 또한 전이 암세포의 특성인 이동성과 침투성이 BCO1에 의해 감소하였고, 이는 MMPs와 TIMPs 유전자 억제, MMP2의 효소활성 및 단백질 조절을 통해 매개됨을 확인하였다. 저산소환경에서 발현되는 HIF-1α 단백질 및 VEGF와 GLUT1의 수준도 억제됨을 규명하였다. 신경모세포종이 간으로 전이된 발병률 및 종양의 평균 부피도 감소하였다. 종양 조직의 분석결과, BCO1군에서 MMPs와 TIMPs의 발현과 암줄기세포마커, HIF-1α 및 VEGF와 GLUT1도 감소함을 증명하였다.
BCO1 효능의 분자적 기전 규명을 위하여 miRNAs 분석 결과, 분화와 관련된 miR-320과 miR-1290의 발현이 증가가 확인되어, BCO1 항암효능의 일부 기전이 miRNAs 조절을 통한 분화 유도의 가능성이 있음을 시사하였다.
이와 같이, 본 연구에서 새롭게 밝혀진 유전자들의 기능과 분자적 기전은 악성 신경모세포종의 암줄기세포를 표적하고 전이를 억제하는 치료법 개발단계에서 유용한 과학적 근거자료로 쓰일 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Neuroblastoma (NB) is childhood malignancy that is the most prevalently diagnosed cancer in pediatric patients. NB originates from immature neural crest cells and possesses properties of cancer stem cell (CSC). CSCs are a small population of cells capable of self-renewal, tumorigenicity, and differentiation. Thus, targeting CSCs has been regarded as a therapeutic strategy to achieve complete remission and overcome metastasis of NB. Beta-carotene (BC) is an active pre-formed vitamin A abundant in dietary sources such as yellow green vegetables and fruits. BC is symmetrically cleaved by the β, β-carotene 15-15’ monooxygenase (BCO1) into two molecules of retinaldehyde. It is further oxidized to retinoic acid (RA), which binds to retinoic acid receptor (RAR) to regulate transcriptionally numerous genes. Despite the effect of BC on anti-cancer stemness has been observed, the molecular mechanism related with RAR is not fully understood. In addition, the roles of BCO1 on cancer stemness and metastasis have not been highlighted yet.
The effects of BC on the expression level of DLK1 and RARs were analyzed by qRT-PCR and western blot. The putative binding site for RARβ was identified using the ALLGEN PROMO database. To evaluate the role of RARB in regulating the self-renewing potential of NB cells, clonogenic assay and sphere assays were performed in RARB silenced cells. Moreover, the mRNA and protein levels of CSC markers, matrix metalloproteinases (MMPs), hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor (VEGF), and glucose transporter1 (GLUT1), were analyzed by qRT-PCR and western blot in the BCO1-overexpressed stable NB cell lines. Using clonogenic and sphere assays, self-renewal capacity in BCO1-overexpressed cell was analyzed. To investigatethe effect of BCO1 on cell migration and cell invasion, wound healing assay and transwell assay were performed. A 45metastatic mouse xenograft model was used to investigate anti-metastatic effect of BCO1.
As a result, among three isotypes of RARs, it was found that RARB played a key role in suppressing DLK1, a bona fide CSC marker of NB. It was further observed that RARβ was directly bound to the DLK1 promoter. RARB mediated anti-cancer effect was significantly reversed by knock-down of RARB showing increased self-renewal potential under BC treatment. The results emphasized the role of BC-induced RARB in suppressing stem-cell properties by direct interaction with DLK1 in NB.
In addition, BC-independent biological functions of BCO1 on anti-cancer stemness and anti-metsatasis of NB were observed. Over-expression of BCO1 resulted in down-regulation of CSC genes expression and inhibition of the self-renewal potential. It consequently decreased cell migration in vitro by suppressing MMPs mRNA expressions. Expression of HIF-1α and its down-stream target genes, VEGF and GLUT1, were inhibited by BCO1. Moreover, the anti-metastatic effect of BCO1 was exerted in vivo by suppressing metastatic tumor incidence and tumor volume. In metastatic hepatic tumors, CSC markers, MMPs, HIF-1α, VEGF, and GLUT1 were suppressed. Finally, miRNAs sequencing array indicated that BCO1 promoted miRNAs related to neuronal differentiation, cell-cell adhesion, and Wnt signaling pathway.
These novel findings highlight the health benefit of RARB-mediated BC and broad insight into the biological function of BCO1 in suppressing cancer stemness as well as metastasis, further regulated miRNAs n human NB cells.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• A. Review of literature 1
• 1. Neuroblastoma 1
• 2. Cancer stem cell 4
• 3. β-carotene and cancer 7
• 4. β, β-carotene-15,15 monooxygenase 1 17
• 5. miRNAs 21
• B. Hypothesis 23
• II. Chapter 1: RARβ enhanced anti-CSC effect of BC by suppressing DLK1 expression in human NB 24
• A. Introduction 24
• B. Materials and Methods 28
• 1. Cell culture and chemicals 28
• 2. Plasmid and transient transfection 28
• 3. BCO1 enzyme activity 29
• 4. HPLC analysis 29
• 5. Identification of potential binding sites for RARs 30
• 6. RNA interference 31
• 7. RNA isolation and qRT-PCR 31
• 8. Western blot 33
• 9. Clonogenic assay 33
• 10. Sphere formation assay 33
• 11. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay 34
• 12. Statistics 34
• C. Results 35
• 1. Measurement of biological conversion of BC into retinoids in human NB cells 35
• 2. Effect of BC on DLK1 expression in human NB cells 40
• 3. Effect of ectopic expression of DLK1 on BC-mediated inhibition of stem cell characteristics 43
• 4. Effect of BC on RARs regulation in human NB cells 46
• 5. Role of RARB in anti-cancer effect of BC on DLK1 expression in human NB cells 48
• 6. Identification of RARE in the DLK1 gene promoter 51
• 7. Effect of BC on the binding of RARβ to the RARE in DLK1 promoter 53
• 8. The regulatory role of RARB in BC-mediated inhibition of self-renewing capacity in human NB cells 55
• D. Discussion 58
• III. Chapter 2: BCO1 inhibited cancer stemness and metastasis and regulated miRNAs in human NB 63
• A. Introduction 63
• B. Materials and Methods 66
• 1. Stable cell line and hypoxic condition 66
• 2. siRNA and BCO1 transfection 66
• 3. Cell migration assay 67
• 4. Cell invasion assay 67
• 5. Gelatin Zymography 67
• 6. RNA isolation and qRT-PCR 67
• 7. Western Blot 70
• 8. Animals 70
• 9. High-throughput small non-coding RNA sequencing 71
• 10. Analysis of differentially expressed miRNAs and target gene prediction 71
• 11. Statistics 71
• C. Results 72
• 1. Effect of BCO1 on CSC markers in the presence of BC in vitro 72
• 2. Effect of BCO1 on CSC markers independent with BC in vitro 77
• 3. Effect of BCO1 on self-renewal potential in vitro 80
• 4. Effect of BCO1 on HIF-1α expression and its down-stream target genes in vitro 83
• 5. Effect of BCO1 on human NB cell migration and invasion in vitro. 85
• 6. Effect of BCO1 mutation and knock-down in cell migration and invasion in vitro 88
• 7. Effect of BCO1 on enzymatic activity of MMP2 in vitro 91
• 8. Effect of BCO1 on gene and protein expression of MMPs in vitro 93
• 9. Effect of BCO1 on EMT-related markers in vitro 95
• 10. Effect of BCO1 on incidence of metastatic tumors in vivo 97
• 11. Effect of BCO1 on volume of metastatic tumors in vivo 99
• 12. Effect of BCO1 on gene expression of CSC markers in vivo 101
• 13. Effect of BCO1 on HIF-1α expression and its down-stream target genes in vivo 103
• 14. Effect of BCO1 on gene expression of MMPs in vivo 105
• 15. Effect of BCO1 on protein levels of MMPs in vivo 107
• 16. Effect of BCO1 on miRNAs profiles 109
• E. Discussion 117
• V. Conclusions 125
• Bibliography 126
• Appendix 144
• 국문초록 150