파킨슨 병 유도 약물 6-OHDA에 의한 RCAN1의 발현 조절 기전

국문 초록 (Abstract)

Parkinson's disease (PD) 는 신경퇴행성 질환으로 떨림, 근육의 경직, 자세 불안정 등의 운동 기능의 장애가 나타나는 질환이다. PD 의 병리학적인 특징으로는 중뇌 흑색질 치밀부 (Substantia Nigra pars compacta, SNpc) 의 도파민성 신경세포의 소실되는 것이다. 이것의 원인으로는 α-Synuclein , Parkin, Phosphatase and tensin homologue (PTEN) -induced kinase 1 (PINK1) , DJ1, Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) 5가지의 유전자에 돌연변이가 생기거나 신경 독성 물질, 농약 등에 노출되기 때문이라고 추정하고 있다. 하지만 도파민성 신경 세포 소실로 인한 PD 유발 원인의 기전은 정확히 알려진 바가 없다.
PD 연구에 이용되는 6-hydroxydopamine (6-OHDA) 는 도파민과 비슷한 구조를 가지고 있어서 도파민성 신경세포와 노르아드레날린성 신경세포 내부로 들어갈 수 있다. 세포 내부로 들어간 6-OHDA 는 도파민성 신경세포와 노르아드레날린성 신경세포를 선택적으로 파괴한다고 알려져 있다.
Regulator of calcineurin 1 (RCAN1, DSCR1, Adapt78, MCIP1) 유전자는 사람의 21번 염색체의 Down syndrome critical region (DSCR) 에 위치하고 있는 유전자로 Down syndrome (DS) 환자에서 과발현 되어있다. RCAN1 은 뇌와 척추, 신경, 골격 그리고 심장 등 다양한 기관에 발현하고 있으며 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그리고 RCAN1 은 Down syndrome 뿐만 아니라 Alzheimer’s disease (AD) 와 같은 신경퇴행성질환, 심장 비대증, 자가면역질환 등 다양한 질병과도 관련이 있다고 알려져 있다.
본 연구에서는 RCAN1 이 6-OHDA 의 타겟 유전자가 될 수 있는지, RCAN1 이 발현되는 신호 전달 기전을 확인하고 6-OHDA 에 의해 발현하는 RCAN1 이 신경 세포에서 어떤 기능을 하는지 확인하고자 실험을 수행하였다. 6-OHDA 를 처리하였을 때, RCAN1.4 의 발현이 증가함을 통해서 RCAN1.4 가 6-OHDA 의 타겟이 됨을 확인하였고 이러한 RCAN1.4 의 발현은 전사 수준에서 조절됨을 확인할 수 있었다. 또한 6-OHDA 를 처리하였을 때 증가하는 활성 산소가 RCAN1.4 의 발현에 영향을 주는 것을 확인 하였고 MAPKs 중 p38 과 JNKs 를 통해서 RCAN1.4 의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 6-OHDA 는 세포 사멸을 일으키는데 RCAN1.4 가 knockdown 된 세포주는 WT 보다 세포 사멸이 증가되었고, RCAN1.4 가 과발현 된 세포주는 WT 보다 세포 사멸이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해서 RCAN1.4 가 파킨슨 병을 유도하는 독성 물질인 6-OHDA 로 부터 세포를 보호하는 역할을 할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

6-hydroxydopamine (6-OHDA) is a neurotoxin that widely used to experimental model's of Parkinson's disease. 6-OHDA is known to enter to dopaminergic neuron through dopamine transporter and produces reactive oxygen species (ROS) in neuron. Therefore, 6-OHDA selectively destroys dopaminergic and noradrenergic neurons. In this study, We found that 6-OHDA increased the protein and mRNA expression of Down Syndrome Critical Region1 (DSCR1/RCAN1), which is overexpressed in the brain of patients with Down syndrome (DS) and the expression of RCAN1.4 was decreased by anti-oxidant. 6-OHDA activated mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and RCAN1.4 was induced by 6-OHDA treatment through MAPKs activation. Furthermore, the increased RCAN1.4 expression by 6-OHDA prevents apopsosis induced by 6-OHDA in catecholaminergic neuron. Our data provide the first evidence that RCAN1.4 acts as a potential target for therapeutic interventions in PD.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 5
• 1. 재료 및 발현 벡터 5
• 2. 세포 배양 5
• 3. Plasmid 제작 6
• 1) 실험방법 6
• 2) Primer 준비 6
• 4. Western blot 7
• 5. Reporter gene assay 7
• 6. RNA 분리 및 Real-time PCR 8
• 1) RNA 분리 8
• 2) Reverse transcription 8
• 3) Primer 준비 9
• 4) Polymerase Chain Reaction 9
• 7. MTT assay 9
• Ⅲ. 결 과 11
• 1. 6-OHDA 는 RCAN1.4 isofrom 의 protein 과 mRNA 의 발현을 증가시킨다 11
• 2. 6-OHDA 에 의한 RCAN1.4 의 발현 증가는 promoter 활성 증가를 통해 나타난다. 16
• 3. 6-OHDA 에 의해 증가한 RCAN1.4 의 발현은 anti-oxidant 에 의해서 감소한다. 19
• 4. 6-OHDA 에 의한 RCAN1.4 의 증가는 MAPKs 를 통해 증가한다. 23
• 5. 6-OHDA 에 의해 발현이 증가하는 RCAN1.4 가 세포를 보호하는 역할을 한다. 28
• Ⅳ. 논 의 34
• Ⅴ. 참고문헌 38