신경세포에서 PACAP 에 의한 RCAN1 의 발현과 분화 조절 기전

李恩惠 강원대학교 대학원 2014 국내석사

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) 는 38개의 아미노산으로 이루어진 neuropepetide 로써 사람의 경우 ADCYAP1 유전자 염기서열로부터 전사된다. PACAP 는 뇌하수체 전엽에서 adenylate cyclase (AC) 를 자극하여 세포 내 cyclic AMP (cAMP) 양을 증가시키며 증가된 cAMP 에 의존적인 신호 전달 기전을 활성화 시키고, calcium 의 influx 를 유도함으로써 calcium 에 의존적인 신호 전달 기전을 활성화시켜 신경계의 발달과 성숙에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 쥐의 부신 수질의 갈색세포 종에서부터 유래된 PC12 세포주의 증식이나 생존, 분화 등 다양한 biological process 를 조절하는 것으로 알려져 있다. Regulator of calcineurin 1 (RCAN1, DSCR1, Adapt78, MCIP1) 유전자는 calcineurin 에 의한 신호 전달 기전을 조절하는 것으로 알려져 있으며 사람의 21번 염색체에 위치하고 있어 다운증후군 환자의 뇌에서 과발현 되어 있고 정상인의 뇌와 척추, 신경 그리고 심장 등 다양한 기관에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 RCAN1 이 PACAP 의 타겟 유전자가 될 수 있는 지와 그것의 발현을 조절하는 신호 전달 기전을 확인하고 PACAP 에 의해 변화하는 RCAN1의 발현이 어떤 기능을 나타내는지 밝히기 위해 실험을 수행하였다. PACAP 를 처리하였을 때, RCAN1.4 의 발현량이 증가하는 것을 관찰함으로써 RCAN1.4 가 PACAP 의 타켓 유전자가 될 수 있음을 확인하였고 이러한 발현 유도는 RCAN1.4 의 전사 수준의 조절을 통해 일어나는 과정임을 확인하였다. PACAP 를 처리하여 증가된 AC활성에 의한 cAMP-PKA 신호전달 기전을 통하여 전사 조절 인자로 알려진 cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein (CREB) 의 인산화가 증가되고, 이것이 RCAN1.4 promoter 내에 존재하는 cAMP-response element (CRE) 에 결합함으로써 RCAN1.4 의 발현량이 증가되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, protein kinase C (PKC) 의 활성과 calcium/calmodulin-dependent protein phosphatase 로 알려진 calcineurin 의 활성을 통해서도 RCAN1.4 가 증가하는 것을 확인하였다. 또한 RCAN1.4 를 과발현시킨 세포주와 shRNA 를 이용해 RCAN1.4 의 발현을 knockdown 시킨 PC12세포주를 이용하여 실험을 수행한 결과 두 세포주 모두에서 PACAP 에 의한 신경세포 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 RCAN1.4 가 PACAP 에 의해 매개되는 신경세포 분화에 새로운 조절자로써 역할 할 수 있음을 밝혀내었다. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) is a 38 amino acid neuropeptide that has been shown to stimulate cAMP formation in rat anterior pituitary cells. PACAP is an evolutionarily well conserved neuropeptide with multiple functions in nervous system. The PACAP is a trophic factor that promotes neuronal development, survival and neurite outgrowth. However, PACAP-mediated intracellular signaling pathways and transcriptional target genes are not completely elucidated. In this study, we found that PACAP induces an increase in the expression of Regulator of calcineurin 1 (RCAN1), which is overexpressed in the brain of patients with Down syndrome (DS). The increased expression of RCAN1 in response to PACAP was mediated by cAMP-dependent PKA/CREB and calcium-dependent calcineurin signaling pathways. Moreover, we showed that altered RCAN1 expression in PC12 cells prevented PACAP-dependent neuronal differentiation. As a result, our data provide the first evidence of RCAN1 as a new regulator to control the neuritogenesis.

흰쥐 해마 신경 세포에서 erythropoietin과 carbamylated erythropoietin의 histone deacetylase 5 인산화 및 핵외수송 촉진 효과에 대한 연구

조혜령 한양대학교 의생명공학전문대학원 2016 국내석사

Erythropoietin (EPO) 는 신경퇴화 동물모델에서 신경영양적 효과를 생성한다. 그러나, EPO 의 임상적 사용은 혈전성 위험에 의해 제한된다. 혈전성 위험이 없는 carbamylated erythropoietin (CEPO) 의 분자 메커니즘은 아직 불완전하지만 새로운 신경보호적, 신경영양적 약물로 제안된다. 이 연구는 EPO 와 CEPO 의 작용에 histone deacetylase 5 (HDAC5) 의 새로운 역할을 제시한다. EPO 와 CEPO 는 protein kinase D (PKD) 의존적 경로를 통해, HDAC5 의 특정 위치인 Ser259 와 Ser498 의 인산화를 조절한다. EPO 와 CEPO 는 HDAC5-GFP 를 발현한 흰쥐의 해마신경세포에서 HDAC5 의 핵외수송을 빠르게 촉진시킨다. 결과적으로, EPO 와 CEPO 는 myocyte enhancer factor-2 (MEF2) 의 표적 유전자의 발현을 증가시킨다. 이러한 결과들은 EPO 와 CEPO 가 HDAC5 의 인산화 조절을 통해 MEF2 표적 유전자의 발현을 조절하는 것을 밝히며, HDAC5 가 EPO 와 CEPO 의 치료 작용에 기여하는 잠재적인 메커니즘이 될 수 있음을 제안한다. Erythropoietin (EPO) produces neurotrophic effects in animal model of neurodegeneration. However, clinical use of EPO is limited due to thrombotic risk. Carbamylated EPO (CEPO), devoid of thrombotic risk, has been proposed as a novel neuroprotective and neurotrophic agent although the molecular mechanisms of CEPO remain incomplete. Here, this study shows a novel role of histone deacetylase 5 (HDAC5) in the actions of EPO and CEPO. EPO and CEPO regulate the HDAC5 phosphorylation at two critical sites, Ser259 and Ser498 through a protein kinase D (PKD)-dependent pathway. In addition, EPO and CEPO rapidly stimulate nuclear export of HDAC5 in rat hippocampal neurons which express HDAC5-GFP. Consequently, EPO and CEPO enhance the myocyte enhancer factor-2 (MEF2) target gene expression. Taken together, these results reveal that EPO and CEPO mediate MEF2 target gene expression via the regulation of HDAC5 phosphorylation at Ser259 and Ser498, and suggest that HDAC5 could be a potential mechanism contributing to the therapeutic actions of EPO and CEPO.

인지질 산화 부산물에 의해 매개되는 Ferroptotic 세포사멸 과정에서의 Gasdermin E 활성화 기전

이소림 아주대학교 일반대학원 2026 국내석사

인지질 산화 부산물에 의해 매개되는 Ferroptotic 세포사멸 과정에서의 Gasdermin E 활성화 기전 Ferroptosis 는 철(iron) 의존적 지질 과산화(lipid peroxidation)에 의해 유도되는 조절된 세포사(regulated cell death)의 한 형태로, apoptosis 나 necrosis 와 구별되는 특징을 가진다. gasdermin E (GSDME)는 apoptosis 동안 caspase-3 에 의해 절단되어 활성화되는 것으로 잘 알려져 있으나, ferroptosis 맥락에서 GSDME 가 어떤 방식으로 활성화되어 포어(pore) 형성에 관여하는지는 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 ferroptosis 과정에서 축적되는 대표적인 지질 과산화 부산물 4-hydroxynonenal (4-HNE)이 GSDME 의 시스테인 잔기를 표적하여 caspase 비의존적인 방식으로 GSDME 활성화와 포어 형성을 유도하는지 여부를 연구하였다. Extracellular vesicle (EVs)는 세포 상태와 세포사 유형에 따라 분비 양과 탑재된 cargo 구성이 크게 변화하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 연구는 ferroptosis 조건에서 4-HNE 에 의해 GSDME 가 활성화될 때 세포막 포어 형성과 더불어 EVs 분비가 어떻게 변화하는지를 함께 평가하였다. HEK293T 세포에서 ferroptosis 유도제(RSL3)를 처리한 결과, caspase-3 억제 조건에서도 GSDME 의 고분자화(oligomerization)와 EVs 분비가 증가하였다. 반면 GSDME 의 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환한 C45A, C180A 및 C45A/C180A 이중 변이체에서는 GSDME 고분자화, 세포막 파열, 그리고 EVs 분비가 현저히 감소하였다. 이는 4-HNE 가 이러한 시스테인 잔기에 공유결합하여 GSDME 활성화와 포어 형성에 기여함을 시사한다. 본 연구는 4-HNE 매개 시스테인 변형을 통한 GSDME 의 새로운 활성화 기전을 제시하고, ferroptosis 동안 일어나는 포어 형성이 EVs 생합성 및 분비를 재구성하는 경로를 보여준다. 이러한 결과는 지질 과산화에 의해 유도되는 포어 형성이 EVs 분비를 조절하는 새로운 축을 제공함으로써, ferroptosis 의 병리학적 의미와 EVs 기반 신호 조절에 대한 새로운 통찰을 제공한다. 핵심어: ferroptosis, Gasdermin E, 4-Hydroxynonenal, 시스테인 변형, EVs 분비

파킨슨 병 유도 약물 6-OHDA에 의한 RCAN1의 발현 조절 기전

구현지 강원대학교 2016 국내석사

Parkinson's disease (PD) 는 신경퇴행성 질환으로 떨림, 근육의 경직, 자세 불안정 등의 운동 기능의 장애가 나타나는 질환이다. PD 의 병리학적인 특징으로는 중뇌 흑색질 치밀부 (Substantia Nigra pars compacta, SNpc) 의 도파민성 신경세포의 소실되는 것이다. 이것의 원인으로는 α-Synuclein , Parkin, Phosphatase and tensin homologue (PTEN) -induced kinase 1 (PINK1) , DJ1, Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) 5가지의 유전자에 돌연변이가 생기거나 신경 독성 물질, 농약 등에 노출되기 때문이라고 추정하고 있다. 하지만 도파민성 신경 세포 소실로 인한 PD 유발 원인의 기전은 정확히 알려진 바가 없다. PD 연구에 이용되는 6-hydroxydopamine (6-OHDA) 는 도파민과 비슷한 구조를 가지고 있어서 도파민성 신경세포와 노르아드레날린성 신경세포 내부로 들어갈 수 있다. 세포 내부로 들어간 6-OHDA 는 도파민성 신경세포와 노르아드레날린성 신경세포를 선택적으로 파괴한다고 알려져 있다. Regulator of calcineurin 1 (RCAN1, DSCR1, Adapt78, MCIP1) 유전자는 사람의 21번 염색체의 Down syndrome critical region (DSCR) 에 위치하고 있는 유전자로 Down syndrome (DS) 환자에서 과발현 되어있다. RCAN1 은 뇌와 척추, 신경, 골격 그리고 심장 등 다양한 기관에 발현하고 있으며 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그리고 RCAN1 은 Down syndrome 뿐만 아니라 Alzheimer’s disease (AD) 와 같은 신경퇴행성질환, 심장 비대증, 자가면역질환 등 다양한 질병과도 관련이 있다고 알려져 있다. 본 연구에서는 RCAN1 이 6-OHDA 의 타겟 유전자가 될 수 있는지, RCAN1 이 발현되는 신호 전달 기전을 확인하고 6-OHDA 에 의해 발현하는 RCAN1 이 신경 세포에서 어떤 기능을 하는지 확인하고자 실험을 수행하였다. 6-OHDA 를 처리하였을 때, RCAN1.4 의 발현이 증가함을 통해서 RCAN1.4 가 6-OHDA 의 타겟이 됨을 확인하였고 이러한 RCAN1.4 의 발현은 전사 수준에서 조절됨을 확인할 수 있었다. 또한 6-OHDA 를 처리하였을 때 증가하는 활성 산소가 RCAN1.4 의 발현에 영향을 주는 것을 확인 하였고 MAPKs 중 p38 과 JNKs 를 통해서 RCAN1.4 의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 6-OHDA 는 세포 사멸을 일으키는데 RCAN1.4 가 knockdown 된 세포주는 WT 보다 세포 사멸이 증가되었고, RCAN1.4 가 과발현 된 세포주는 WT 보다 세포 사멸이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해서 RCAN1.4 가 파킨슨 병을 유도하는 독성 물질인 6-OHDA 로 부터 세포를 보호하는 역할을 할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 6-hydroxydopamine (6-OHDA) is a neurotoxin that widely used to experimental model's of Parkinson's disease. 6-OHDA is known to enter to dopaminergic neuron through dopamine transporter and produces reactive oxygen species (ROS) in neuron. Therefore, 6-OHDA selectively destroys dopaminergic and noradrenergic neurons. In this study, We found that 6-OHDA increased the protein and mRNA expression of Down Syndrome Critical Region1 (DSCR1/RCAN1), which is overexpressed in the brain of patients with Down syndrome (DS) and the expression of RCAN1.4 was decreased by anti-oxidant. 6-OHDA activated mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and RCAN1.4 was induced by 6-OHDA treatment through MAPKs activation. Furthermore, the increased RCAN1.4 expression by 6-OHDA prevents apopsosis induced by 6-OHDA in catecholaminergic neuron. Our data provide the first evidence that RCAN1.4 acts as a potential target for therapeutic interventions in PD.

난황 알부민 알레르기 마우스 모델에서 다가형 사람 IgG 의 항알레르기 효과 검증과 기전 규명

양승정 아주대학교 2022 국내석사

배경: 알레르기질환은 환경 내에 존재하는 물질들에 대한 과민한 면역반응(알레르기 반응)으로 인하여 발생한다고 알려져 있다. 과거 연구들에서 건강헌혈자들의 모듬혈장으로부터 분리된 다가형 면역글로불린 G (사람 IgG)를 알레르기질환 환자들에게 정맥 혹은 피하주사로 투여 시, 알레르기질환을 호전시키는 치료효과(항알레르기 효과)가 있다고 보고된 바 있으나, 아직까지 다가형 사람 IgG 의 항알레르기 효과와 그 작용 기전은 명확하게 규명되지 않은 상태이다. 이에 연구자는 본 연구에서 난황 알부민(ovalbumin, OVA)알레르기 마우스 모델에 시판중인 주사용 다가형 사람 IgG 제제를 투여하여 항알레르기 효과를 나타내는지를 검증하고, 항알레르기 효과를 나타내는 면역학적인 기전을 규명하고자 하였다. 연구방법: OVA 알레르기 마우스 모델을 만들기 위하여 BALB/c 마우스에 OVA과 alum 을 혼합하여 복강 내로 0주, 1주, 2주에 총 3회 주사하여 감작시킨 후, 알레르기 반응을 억제하기 위한 치료제로서 사람 IgG 또는 음성 대조로 saline 혹은 사람 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 각 군의 처치 방식에 따라 0주, 1주, 2주에 총 3 회 피하주사로 투여하였다. 사람 IgG 와 면역증강제인 complete Freund's adjuvant (CFA)를 함께 투여한 경우 또는 아닌 경우로 서로 다른 2개의 실험조건으로 진행하였다. <사람 IgG와CFA를 혼합하여 피하주사 처치한1차 실험조건>에서는 마우스 각 군당 6마리씩 다음과 같이 총 8군으로 무작위 배정하였다. OVA로 감작시키지 않고 saline 을 처치한 군, 음성 대조군으로서 OVA 감작시킨 후 saline 만을 처치한 군, HSA 20mg 과 CFA를 혼합하여 처치한 군, OVA 감작 후CFA를 혼합한 사람 IgG를 각각 1mg, 10mg, 20mg, 50mg 처치한 군, 그리고 CFA 없이 사람 IgG 20mg 만을 3 회 처치한 군으로 분류하였다. <CFA를 처치하지 않은 2차 실험조건>에서는 BALB/c 마우스에 OVA 감작한 후 saline 또는 사람 IgG 50mg 만을 피하주사 처치한 군으로 각 군당 6마리씩 총 12마리로 실험을 실시하였다. 모든 마우스는 21일차에 희생한 후 혈액과 비장 샘플을 채취하여 분석에 사용하였다. 연구결과: 음성 대조군인 OVA 감작 후 saline 만을 처치한 군과 비교한 결과는 다음과 같다. (1) 사람 IgG 50mg을 피하주사 시 CFA 혼합 여부와 상관없이 <실험조건 1 과 2>에서OVA-특이 IgE항체 역가의 평균치가 유의하게 감소되었다(p=0.038, p=0.028, respectively). (2) <실험조건 1>에서 OVA-특이 IgG 항체 역가의 평균치가 사람 IgG 50mg 과 CFA를 함께 피하주사 하였을 때 유의하게 감소되었다(p<0.001). (3) 혈청 내 total IgE 는 <실험조건 1>의 사람 IgG 10mg을 CFA 와 함께 처치한 군과 <실험조건 2>의 사람 IgG 50mg 을 피하주사 처치한 군에서 통계적으로 유의하게 증가되었다(p=0.005, p=0.001, respectively). (4) <실험조건 1>에서 CFA 와 사람 IgG 를 20mg 처치시 또는 <실험조건 2>에서 사람 IgG 50mg 피하주사 시, 비장의 무게가 유의하게 증가되었다(p=0.024, p=0.004, respectively). (5) <실험조건 1>에서 비장세포를 OVA 와 함께 배양한 배양액의 상층액에서 사이토카인 농도를 측정한 결과, 사람 IgG 50mg 을 처치한 군에서 IL-10, TNF-α, IFN-γ, IL-4 의 농도가 유의하게 증가되었다(p<0.05). (6) <실험조건 1 과 2>에서 사람 IgG 전체와 사람 IgG F(ab')2 분절에 대한 마우스 IgG 항체의 역가가 사람 IgG 50mg 을 피하주사 하였을 때 유의하게 증가되었다(p<0.05). 결론: OVA 알레르기 마우스 모델에서 고용량의 사람 IgG 를 피하주사 시, OVA-특이 IgE 항체의 생성을 억제하는 항알레르기 효과와 비장세포에서 여러 종류의 사이토카인 생성을 증가시키는 면역조절 효과 그리고 사람 IgG의 F(ab')2 분절에 대한 IgG 항체 반응이 유도됨을 확인할 수 있었다. 향후 다가형 사람 IgG가 항알레르기 효과를 나타내는 상세한 작용 기전을 규명하기 위한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다. Background: Allergic diseases are known to be caused by an hypersensitive immune response to common environmental agents. Previous studies have reported that polyvalent immunoglobulin G (human IgG) purified from plasma pool of health blood donors has an anti-allergic effect and improves allergic diseases when administered by intravenously or subcutaneous injection. However, there are few studies that demonstrated its anti-allergic effect and mechanism of action. In this study, we tried to evaluate an anti-allergic effect of polyvalent human IgG in the ovalbumin (OVA) allergy mouse model, and to classify its therapeutic mechanism. Method: To establish an OVA allergy mouse model, 0.4mg/ml OVA and 20mg/ml aluminum hydroxide were mixed and injected into the abdominal cavity of 3 times for 2 weeks and then human IgG was administered by subcutaneous injections as a treatment to 6 weeks old female BALB/c mice. When administering human IgG by subcutaneous injection to mice, two different experimental conditions were sequentially performed depending on whether complete Freund's adjuvant (CFA)(as an adjuvant) was mixed or not. In <First experimental conditions treated by mix human IgG and CFA>, 6 animals per group were randomly assigned to a total of 8 groups as follows. A mouse group that was not sensitized with OVA, a group that was sensitized with OVA and then treated with saline, or a group that was treated by the mixture of human serum albumin (HSA) and CFA, and other mouse groups administrating by mixture of human IgG and CFA was classified with 1mg hIgG, 10mg hIgG, and 20mg hIgG and 50mg hIgG groups. In <Second experimental conditions without CFA>, after OVA sensitization, 6 mice were treated by saline or 6 mice were treated by 50mg hIgG. Blood and spleen samples were taken on the 21st day and used for analysis. Result: The negative control mouse group treated with saline and the high-dose hIgG (50mg) treated group were compared after OVA sensitization. Result, (1) high-dose human IgG significantly decreased the titer of OVA-specific IgE antibodies in both experimental conditions 1 and 2 (p=0.038, p=0.028, respectively). (2) The titer of OVA-specific IgG antibody was significantly decreased when treated by a mixture of 50mg of human IgG and CFA (p=0.028). (3) Total IgE in serum was significantly increased in mouse group, treated with a mixture 20mg of hIgG and CFA or 50mg of hIgG only, experimental conditions 1 and 2 (p=0.005, p=0.001, respectively). (4) High-dose human IgG increased, the weight of the mouse spleen (p=0.024, p=0.004, respectively). (5) High-dose hIgG (50mg) treatment significantly increased the concentrations of IL-10, TNF-α, IFN-γ, IL-4 cytokines in the culture supernatant of the spleen cells stimulated OVA were significantly increased in the group treated with high dose of human IgG (50mg) in experimental condition 1 (p<0.05). (6) Mouse IgG antibodies to whole molecule of human IgG and F(ab')2 fragment of human IgG were significantly increased in mouse groups treated with high doses of human IgG (50mg). Conclusion: This study showed in OVA allergy mouse model (1) high-dose human IgG treatment group significant anti-allergic effect decreasing serum levels of allergen-specific IgE. (2) Immunomodulatory effect increasing producing various cytokines from spleen cells allergen stimulation. (3) Significantly Induced mouse IgG antibodies response to both human IgG and F(ab')2 fragment of human IgG. Further research is necessary to evaluate the mechanism of exhibiting an anti-allergic effect by polyclonal human IgG.

Non-invasive markers of diagnosis and recurrence in patients with hepatocellular carcinoma

손주아 아주대학교 일반대학원 2023 국내석사

Chapter 1 in silico HCC 에서 우리는 유전자 발현 분석을 사용하여 의 재발을 예측할 수 있는 유전자 시그니처를 조사하였다 재발 관련 유전자 후보들은 간절제술을 시행한 . - HCC 환자로부터 두가지의 독립적인 전사체분석 데이터세트를 통해 유전자 발현 프로파 일의 상호분석하여 선정되었다 다섯개의 후보 유전자 . , CENT2, HMGA1, MPZL1, RACGAP1 SNRPB qRT-PCR 과 가 확인되었고 이들 유전자의 발현은 을 통해 검증코호트 (n=57) . MPZL1 CENT2, HMGA1, RACGAP1 SNRPB 에서 평가되었다 을 제외한 과 는 재 발이 일어난 환자에서 더욱 과발현 되는 것을 확인할 수 있었다 게다가 과 . HMGA1 MPZL1 AUC (0.807, 95% CI = 0.681-0.899) HCC 의 조합이 가장 좋은 값 로 의 재발을 예측할 수 있는 것으로 나타났다 임상병리학적 상관관계에서 미세혈관 침범 환자에서는 . CENT2, MPZL1, RACGAP1, SNRPB , Edmonson 가 과발현되었고 종양 분화등급에 비례 하여 과 의 발현이 증가하는 것을 확인하였다 또한 및 MPZL1 SNRPB . , CENT2, HMGA1 RACGAP1 (OS) (DFS) 의 과발현은 검증 세트에서 좋지 않은 전체 생존 및 무병 생존 과 관련이 있었다 마지막으로 회귀분석은 혈청 알파 태아단백 및 의 발현이 . Cox - RACGAP1 전체 생존에 유의한 영향을 미치는 반면 혈소판 수 미세혈관 침범 및 의 발현 , , HMGA1 은 무병 생존에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다 결록적으로 과 . HMGA1 MPZL1 의 조합은 수술적 간 절제 후 재발을 예측할 수 있는 바이오마커가 될 수 있다. Chapter 2 Splicing 에서 우리는 간세포 암종에 대한 새로운 비침습적 바이오마커로써 Factor 3b Subnint 4 (SF3B4) HCC SF3B4 의 진단적 가치와 에서 발현과 면역 세포 침 윤 사이의 관계를 확인하는 것을 목표로 하였습니다 를 사용하여 만성 간염 간경 . ELISA , 화 및 환자와 건강한 대조군 환자의 혈장 샘플에서 발현을 검출하고 HCC SF3B4 SF3B4 를 검출할 수 있는 자가 항체의 발현량을 각 환자군의 혈장 검체에서 측정하였습니다. 환자의 혈장 내 의 단백질 및 자가항체의 발현을 확인한 결과 환자에서 SF3B4 , HCC SF3B4 AFP 및 자가항체 발현이 건강한 대조군보다 높게 나타났으나 에 비해 더 좋은 진 단 성능을 나타내지는 않았습니다 의 발현은 혈청 엑소좀에서 증가하였으 . SF3B4 mRNA 나 나 혈청에서는 증가하지 않았습니다 혈청 엑소좀 는 모든 단계의 , buffy coat . -SF3B4 HCC HCC AFP . RNA 및 초기 단계 에서 보다 나은 진단력을 보였습니다 단일 세포 시퀀 싱에 따르면 는 와 상관관계가 있었습니다 데이터 베이스를 사용 SF3B4 MDSCs . TIMER 하여 에서 의 발현과 면역 침윤 수준의 상관관계를 조사했습니다 결론적으로 혈청 엑소좀 는 새로운 비침습적 바이오마커 후보이며 는 -SF3B4 SF3B4 HCC 에서 종양 면역 침윤을 유도할 수 있을 것으로 암시되었습니다. In chapter 1, We investigated prognostic gene signatures for predicting HCC recurrence using in silico gene expression analysis. Recurrence-associated gene candidates were chosen by a comparative analysis of gene expression profiles from two independent whole-transcriptome datasets in patients with HCC who underwent surgical resection. Five promising candidate genes, CETN2, HMGA1, MPZL1, RACGAP1, and SNRPB were identified, and the expression of these genes was evaluated using quantitative reverse transcription PCR in the validation set (n = 57). CETN2, HMGA1, RACGAP1, and SNRPB, but not MPZL1, were upregulated in patients with recurrent HCC. In addition, the combination of HMGA1 and MPZL1 demonstrated the best area under the curve (0.807, 95% confidence interval [CI] = 0.681-0.899) for predicting HCC recurrence. In terms of clinicopathological correlation, CETN2, MPZL1, RACGAP1, and SNRPB were upregulated in patients with microvascular invasion, and the expression of MPZL1 and SNRPB was increased in proportion to the Edmonson tumor differentiation grade. Additionally, overexpression of CETN2, HMGA1, and RACGAP1 correlated with poor overall survival (OS) and disease-free survival (DFS) in the validation set. Finally, Cox regression analysis showed that the expression of serum alpha-fetoprotein and RACGAP1 significantly affected OS, whereas platelet count, microvascular invasion, and HMGA1 expression significantly affected DFS. In conclusion, the combinatin of HMGA1 and MPZL1 might be potential prognostic biomarkers for predicting the recurrence of HCC after surgical resection. In chapter 2, we aimed to identify the diagnostic value of the Splicing Factor 3b Subunit 4 (SF3B4) as a novel non-invasive biomarker for hepatocellular carcinoma (HCC) and the relationship between SF3B4 expression and immune cell infiltration in HCC. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect SF3B4 level in plasma samples of each patient with healthy control, with chronic hepatitis (CH), liver cirrhosis (LC), and HCC. Expression levels of auto-antibody, which can detect SF3B4, were measured in plasma samples of each group of patients. As a result of confirming the expression of SF3B4 protein and autoantibody in the patient's plasma using ELISA, the SF3B4 and autoantibody expression in HCC patients was higher than the healthy controls, but it did not show better diagnostic performance compared to AFP. The mRNA expression of SF3B4 was increased in serum EV, but not in the buffy coat or serum of HCC patients. Serum EV-SF3B4 had better diagnostic power in all stage HCC and early-stage HCC (AUC=0.884 and AUC=0.933, respectively) than AFP (AUC=0.673 and AUC=0.534, respectively). According to single cell RNA sequencing, SF3B4 was correlated with MDSCs. TIMER database was used to investigate the correlation of SF3B4 expression and immune infiltration level in HCC. In conclusion, EV-SF3B4 is a candidate novel non-invasive biomarker for diagnosing HCC and SF3B4 might induce tumor immune infiltration in HCC. Chapter 1 in silico HCC 에서 우리는 유전자 발현 분석을 사용하여 의 재발을 예측할 수 있는 유전자 시그니처를 조사하였다 재발 관련 유전자 후보들은 간절제술을 시행한 . -HCC 환자로부터 두가지의 독립적인 전사체분석 데이터세트를 통해 유전자 발현 프로파일의 상호분석하여 선정되었다 다섯개의 후보 유전자 . , CENT2, HMGA1, MPZL1, RACGAP1 SNRPB qRT-PCR 과 가 확인되었고 이들 유전자의 발현은 을 통해 검증코호트(n=57) . MPZL1 CENT2, HMGA1, RACGAP1 SNRPB 에서 평가되었다 을 제외한 과 는 재발이 일어난 환자에서 더욱 과발현 되는 것을 확인할 수 있었다 게다가 과 . HMGA1MPZL1 AUC (0.807, 95% CI = 0.681-0.899) HCC 의 조합이 가장 좋은 값 로 의 재발을 예측할 수 있는 것으로 나타났다 임상병리학적 상관관계에서 미세혈관 침범 환자에서는 .CENT2, MPZL1, RACGAP1, SNRPB , Edmonson 가 과발현되었고 종양 분화등급에 비례하여 과 의 발현이 증가하는 것을 확인하였다 또한 및 MPZL1 SNRPB . , CENT2, HMGA1RACGAP1 (OS) (DFS) 의 과발현은 검증 세트에서 좋지 않은 전체 생존 및 무병 생존 과 관련이 있었다 마지막으로 회귀분석은 혈청 알파 태아단백 및 의 발현이 . Cox - RACGAP1 전체 생존에 유의한 영향을 미치는 반면 혈소판 수 미세혈관 침범 및 의 발현 , , HMGA1은 무병 생존에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다 결록적으로 . HMGA1 MPZL1의 조합은 수술적 간 절제 후 재발을 예측할 수 있는 바이오마커가 될 수 있다. Chapter 2 Splicing 에서 우리는 간세포 암종에 대한 새로운 비침습적 바이오마커로써 Factor 3b Subnint 4 (SF3B4) HCC SF3B4 의 진단적 가치와 에서 발현과 면역 세포 침윤 사이의 관계를 확인하는 것을 목표로 하였습니다 를 사용하여 만성 간염 간경 . ELISA ,화 및 환자와 건강한 대조군 환자의 혈장 샘플에서 발현을 검출하고 HCC SF3B4 SF3B4 를 검출할 수 있는 자가 항체의 발현량을 각 환자군의 혈장 검체에서 측정하였습니다. 환자의 혈장 내 의 단백질 및 자가항체의 발현을 확인한 결과 환자에서 SF3B4 , HCCSF3B4 AFP 및 자가항체 발현이 건강한 대조군보다 높게 나타났으나 에 비해 더 좋은 진단 성능을 나타내지는 않았습니다 의 발현은 혈청 엑소좀에서 증가하였으 . SF3B4 mRNA나 나 혈청에서는 증가하지 않았습니다 혈청 엑소좀 는 모든 단계의 , buffy coat . -SF3B4HCC HCC AFP . RNA 및 초기 단계 에서 보다 나은 진단력을 보였습니다 단일 세포 시퀀싱에 따르면 는 와 상관관계가 있었습니다 데이터 베이스를 사용 SF3B4 MDSCs . TIMER하여 에서 의 발현과 면역 침윤 수준의 상관관계를 조사했습니다 HCC SF3B4 .결론적으로 혈청 엑소좀 는 새로운 비침습적 바이오마커 후보이며 는 -SF3B4 SF3B4 HCC에서 종양 면역 침윤을 유도할 수 있을 것으로 암시되었습니다.

A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis of P19 cells

고해영 차의과학대학교 대학원 2015 국내박사

분자 비컨 (Molecular beacon, MB) 은 짧은 oligonucleotide 로써 보통은 stem-loop 구조로, 한쪽 끝에는 형광탐침과 다른 한쪽에는 그 형광을 끌 수 있는 quencher 가 달려 있는 형태이다. 이러한 MB 은 세포내에 존재하는 생체 분자를 감지하는데 주로 사용되고, miRNA 의 발현을 감지하는데도 많이 사용된다. 하지만 기존의 MB 은 한 가지 형광탐침만 사용하여 형광의 꺼짐/ 켜짐 시스템을 통하여 miRNA 를 감지하게 되는데, 이 경우 형광의 밝기가 약하게 나타날 때, 이 약한 밝기가 감지하려고 하는 miRNA 의 발현이 적은 것에 기인하는지 아니면 MB 의 transfection 효율이 낮은 것에 기인하는지를 구분하기가 어렵다. 또한 기존의 stem-loop 구조는 구조 변화에 의해 형광이 켜지는 시스템으로 quencher 가 완전히 분리 되지 않아 quencher 의 영향을 다소 받을 수 있다는 단점이 있다. 본 연구에서는 이러한 단점을 극복하기 위해 두 가지 형광 탐침을 이용한 linear 구조로, 색의 변화로써 miRNA 의 발현을 감지할 수 있는 MB 을 개발하였다. target 으로 보고자 하는 miRNA 는 신경분화과정에서 발현이 증가하는 miR-9 으로, P19 세포를 retinoic acid 처리를 하여 신경세포로 분화시켜 그 과정동안의 miR-9 의 발현 양상을 색변화 miR-9 MB (color-tunable miR-9 MB, ColoR9 MB)의 색변화로 관찰하고자 한다. ColoR9 MB 는 부분적으로 이중가닥을 갖는 oligonucleotide 로써, 긴 가닥에는 miR-9 이 결합할 수 있는 상보적인 sequence 를 가지고 양쪽 말단에는 한 쪽에는 reporter probe 로 Cy3 형광을 달고, 다른 한 쪽에는 referenece probe 로 Cy5.5 형광을 달았다. 그리고 짧은 가닥에는 Cy3 형광을 끌 수 있는 quencher 인 BHQ1 을 달아 긴 가닥과 짧은 가닥의 oligonucleotide 가 부분적으로 수소결합을 이룰 수 있도록 디자인하였다. 두 가닥의 수소결합을 통해 합성된 ColoR9 MB 는 먼저 tube 에서 그 기능을 확인한 후, miR-9 의 negative cell 인 CHO cell 에 exogenous miR-9 와 동시에 이입하여 miR-9 을 감지 할 수 있는지를 확인하였고, 신경 분화를 유도한 P19 cell 에 이입하여서는 endognous miR-9 을 감지할 수 있는지를 확인하였다. 또한 ColoR9 MB 가 이입된 P19 cell 을 마우스에 이식해 in vivo 에서도 miRNA 영상이 가능한지를 확인하였다. miR-9 이 존재 하지 않을 때는 reporter probe 인 Cy3 형광 (연두색)은 quencher 에 의해 꺼져 있어 형광이 나타나지 않고 reference probe 인 Cy5.5 형광 (빨간색)은 quencher 와 충분히 떨어져 있으므로 quencher 의 영향을 받지 않아 항시 켜 있게 되어 세포 안의 ColoR9 MB 의 색은 빨간색으로 나타나게 된다. 그러나 miR-9 이 존재할 때는 miR-9 이 ColoR9 MB 의 상보적인 sequence 에 더 높은 결합력으로 결합하므로 quencher 가 달린 짧은 가닥이 떨어지게 되어 Cy3 형광이 켜지게 되고 Cy5.5 형광은 항상 켜 있으므로 두 색의 혼합색인 노란색으로 색의 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 reference probe 인 Cy5.5 가 transfection 효율을 나타내 보여 줄 수 있고 quencher 가 형광탐침으로부터 완벽히 분리 되기 때문에 더 정확하게 색변화를 통해 miR-9 의 발현을 감지할 수 있는 방법이 된다. 이러한 방법은 다른 miRNA 에도 적용이 가능하여 다양한 miRNA 의 발현과 그 기능을 이해하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이라 예상한다. Molecular beacon (MB), a synthetic oligonucleotide labeled with a fluorophore at one end and a quencher at the other end, has been used to sense intracellular biomolecules including microRNAs (miRNA, miR) which play critical role in cellular developments and diseases. However, the on/off-tunable miRNA MB is difficult to distinguish a change of miRNA expression in cells when the fluorescence brightness is weak due to low expression of miRNA or low transfection of the miRNA MB. To overcome the limitation, we developed a color-tunable miRNA9 MB (ColoR9 MB) to sense miR-9 expression-dependent color change. The ColoR9 MB was synthesized by a partially double-stranded DNA oligonucleotide containing a miR-9 binding site and a reporter probe with Cy3/black hole quencher 1 (BHQ1) at one end and a reference probe with Cy5.5 at the other end. The ColoR9 MB was transfected into CHO and P19 cells. In the absence of miR-9, the ColoR9 MB visualized with red color because Cy3 (green) reporter probe was quenched by BHQ1 and Cy5.5 (red) reference probe was remained constant. However, in the presence of miR-9 in CHO cells and during neuorgenesis of P19 cells where the expression of endogenous miR-9 was gradually increased, the reporter probe of the ColoR9 MB showed miR-9 expression-dependent green fluorescence recovery and red fluorescence of the reference probe remained invariable. The ColoR9 MB visualized CHO and P19 cells with red color in the absence of miR-9 and yellow color in the presence of miR-9. In vivo imaging demonstrated that the green fluorescence recovery of the reporter probe from the ColoR9 MB was gradually increased during neuronal differentiation of P19 cells while red fluorescence activity of the reference probe remained constant. This is because gradual increase in miR-9 expression during neurogenesis of P19 cells was bound to the miR-9 binding site and resulted in the detachment of the quencher oligonucleotide from the ColoR9 MB and fluorescence recovery. This great color-tunable specificity of the ColoR9 MB to sense miR-9 expression-and neurogenesis-dependent color change will be useful for understanding the expression and function of other miRNAs in vitro and in vivo.

Studies on the anti-obesity effects of Celosia cristata flower extract in vitro and in vivo

UPRETY LAXMI PRASAD 아주대학교 일반대학원 2024 국내박사

비만(Obesity)은 에너지의 섭취와 소비의 불균형으로 인해 몸에 비정상적이고 과도하게 지방이 축적된 것을 말한다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 ‘건강을 해칠 정도로 지방조직에 비정상적인 또는 과도한 지방이 축적된 상태’로 정의하고 있다. 비만은 비정상적인 대사 활동을 유발하여 제2형 당뇨병, 심혈관질환, 지방간, 고혈혈압, 염증, 암 등의 여러가지 성인병의 중요한 원인이 되는 것으로 밝혀졌다. 최근 전세계적으로 비만 환자가 급증하고 있으며, 개인의 건강 증진과 국가의 의료비 절감을 위해 반드시 해결해야할 문제가 되어있다. 고도 비만의 치료를 목적으로 하는 몇 가지 약물이 개발되어 사용되고 있으나 크고 작은 부작용의 문제가 발생되고 있다. 이에 장기적인 사용에도 부작용이 적은 천연물 유래의 비만 예방, 개선, 치료 물질 개발에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서는 다양한 천연물 추출물의 지방세포 분화억제 효능에 대한 탐색(Screening)을 통해 발굴된 맨드라미(Celosia cristata, CC)의 꽃 추출물의 항비만 효과를 조사하고자 하였다. 항비만에 대한 대표적인 시험관 내(In vitro)와 생체 내(In vivo) 실험 시스템을 이용하여 맨드라미(Celosia cristata)의 꽃의 30% 에탄올 추출물(Ethanol extract)의 유효성 평가와 작용기전 규명에 대한 연구를 목표로 하였다. 먼저, 지방전구세포(Preadipocyte)인 3T3-L1 세포와 쥐의 지방유래 줄기세포(Adipose derived stem cell; ADSC)를 사용하여 실험하였다. 지방세포로 분화를 유도한 후, 맨드라미 꽃 추출물을 농도 별(10, 20, 50 µg/ml)로 처리한 결과, 두가지 세포 모두에서 농도 의존적으로 지방세포 분화(Adipocyte differentiation)와 지방세포 내의 지질 방울 축적(Lipid droplet accumulation)이 유의미하게 감소하였다. 또한, 세포 상층액에서 트리아실글리세롤(Triacylglycerol) 농도의 감소와 글리세롤(Glycerol) 농도의 증가가 나타났다. 다음은, 고지방 식이(High-fat diet; HFD)와 정상 식이(Normal diet; ND)로 사육한 수컷 마우스를 사용하여 총 3가지의 독립된 디자인의 동물 실험을 시행하였다(① 마우스에 HFD 식이 시작과 동시에 실험물질 투여 + HFD 식이, ② HFD 식이로 비만 마우스 제작 후 실험물질 투여 + HFD 식이, ③ HFD 식이로 비만 마우스 제작 후 실험물질 투여 + ND 식이). 동물실험 양성 대조군으로는 가르시니아캄보지아 추출물(Garcinia cambogia extract; 100 mg/kg/day)을 사용하였다. 맨드라미 꽃 추출물 농도 별(25, 50, 100 mg/kg/day)로 투여한 결과 상기의 3가지 실험 디자인 모두에서, 대조군과 대비해서 농도 의존적으로 체중 증가 억제, 대사 이상 개선, 지방분해(Lipolysis) 연관 인자(Hsl, Acox1, Cpt2)의 발현 증가, 지방형성(Adipogenesis) 연관 인자(Pparγ, Cebpa, Fabp4, Fasn)의 발현 감소가 나타났다. 또한, 대사 케이지(Metabolic cage) 모니터링 시스템을 통한 대사 관련 인자의 분석 결과, 맨드라미 꽃 추출물 투여 HFD 유도 비만 마우스에서 산소 소비량(Volume of oxygen consumption; VO2), 이산화탄소 생성량(Volume of carbon dioxide production; VCO2), 호흡 교환율(VCO2/VO2, respiratory exchange ratio, RER) 및 에너지 소비(Energy expenditure, EE)의 유의적 증가가 나타났다. 체지방 감소와 근육량 증가와 더불어 부고환 지방 조직(Epididymal adipose tissue)에서의 미토콘드리아 활동 및 에너지 대사 관련 인자(Ucp1, Pgc1a, Prdm16, Cytc, Cox4b, Mccad)의 mRNA 발현량이 증가된 것을 확인하였다. 또한, 마우스 혈장의 생화학 분석 결과, 저밀도 지질 단백질(Low-density lipoprotein; LDL), 총 콜레스테롤(Total cholesterol; TC), 중성지방(Triglyceride; TG)의 유의적인 감소와 고밀도 지질 단백질(High-density lipoprotein; HDL)의 유의적인 증가를 확인하였다. 더욱이, 혈장 내 간 염증 관련 마커인 aspartate transaminase (AST)와 alanine transaminase, aka alanine aminotransferase (ALT)의 수준이 유의미하게 감소되어 있었다. 이러한 결과는 맨드라미 꽃 추출물이 비만 마우스의 지방간 및 지방세포 비대와 같은 대사이상 개선과 중성 지방 및 콜레스테롤 관련 질환의 발병 위험을 줄이는데 큰 효과가 있음을 시사한다. 끝으로, 경구 포도당 내성 검사(Oral glucose tolerance test; OGTT)와 인슐린 내성 검사(Insulin tolerance test; ITT) 결과에서, 포도당 흡수와 인슐린 감수성을 현저하게 개선하였다. 결론적으로, 본 연구에서 맨드라미 꽃 추출물은 지방형성 억제, 지방분해 촉진 및 미토콘드리아 에너지 대사 관련 인자 조절을 통하여 HFD에 의한 체중 증가를 억제하고 비만 관련 표현형(Phenotype)을 개선하는 것을 증명하였다. 이러한 연구결과는 맨드라미 꽃 추출물이 향후 비만 및 관련 대사이상 질환의 예방, 개선, 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. ______________________________________________________________________________________________ 키워드: 비만, 맨드라미 꽃, 추출물, 지방세포, 고지방식이, 동물실험, 대사이상 질환, 지방형성, 지방분해, 에너지 대사 Obesity, characterized by the accumulation of excess calories in mature adipocytes in the form of lipids, can trigger aberrant metabolic activity. Effective management of obesity-related abnormalities is crucial to control obesity. However, conventional drugs designed to manage obesity frequently exhibit significant long-term adverse effects. In contrast, natural and herbal supplements have minimal or no long-term adverse health effects. Consequently, herbal medicines and supplements have emerged as promising areas of interest, surpassing conventional pharmaceuticals as obesity management strategies. Here, I explored the anti-obesity effects of a Celosia cristata (CC) total flower- extract in vitro using mouse pre-adipocytes 3T3-L1 and adipose-derived stem cells induced by adipogenic differentiation medium and co-treated with varying concentrations of CC (10, 20, and 50 µg/mL). CC shows significant reduction in adipocyte differentiation and lipid droplet accumulation, with diminished intracellular triacylglycerol and increased glycerol concentration in cell supernatant, in a dose-dependent manner. Further, supplementation with CC (25, 50, and 100 mg/kg/day) or Garcinia cambogia (GC, 100 mg/kg/day) as a positive control for varying treatment durations according to diet patterns shows significant body weight reduction, improvements in metabolic abnormalities, enhanced lipolysis-related factors (Hsl, Acox1, and Cpt2), and reduced adipogenesis-related factors (Pparγ, Cebpa, Fabp4, and Fasn) in high-fat diet (HFD)-induced obese mice. In addition, metabolic parameters observed using the metabolic cage monitoring system, demonstrated that CC supplementation increased oxygen consumption (VO2), carbon dioxide expiration (VCO2), respiratory exchange ratio (RER=VCO2/VO2), and energy expenditure (EE) in HFD-induced obese male mice. This leads to decreased body fat and increased lean body mass in mice, complemented by enhanced mRNA expression levels of mitochondrial activities and energy metabolism associated factors (Ucp1, Pgc1a, Prdm16, Cytc, Cox4b, and Mccad) in the epididymal adipose tissue. As a result, these changes inhibited metabolic abnormalities such as hepatic steatosis and adipocyte hypertrophy, as determined by histomorphological analysis of the liver and epididymal adipose tissues. Furthermore, blood plasma biochemical analysis showed that, CC treatment ameliorated the levels of low-density lipoprotein, total cholesterol, triglyceride, and high-density lipoprotein, in HFD-induced obese mice, indicating an improvement in cholesterol-associated abnormalities that usually persist in HFD-fed obese mice, suggesting that CC could be a beneficial natural supplement to mitigate the risk of developing cholesterol-associated diseases. In addition, CC significantly reduced the blood plasma levels of the liver inflammation- related markers; AST and ALT, which highlighted its role in minimizing liver inflammation caused by fat accumulation during HFD-induced obesity. Moreover, CC remarkably improved glucose absorption, and insulin sensitivity in HFD-induced obese mice, as indicated by the outcomes of the oral glucose (OGTT) and insulin tolerance tests (ITT), respectively. In summary, my in vitro and in vivo studies demonstrate that supplementation with CC total flower extract effectively regulates adipogenesis, lipolysis, and mitochondrial energy metabolism-related factors, thereby inhibiting body weight gain and improving obesity-associated abnormalities. These findings suggest that the CC flower extract could be a potential natural herbal supplement for preventing and managing obesity and its associated metabolic disorders. __________________________________________________________________ Keywords: Obesity, Celosia cristata flower, Extract, Adipocytes, High-fat diet, Animal study, Metabolic disorder, Adipogenesis, Lipolysis, Energy metabolism

농축 혈소판(PRP)의 사이토카인 분포와 피부 세포의 증식 및 이동에 미치는 matrix metalloproteinase(MMPs)의 조절 연구

박홍범 차의과학대학교 대학원 2012 국내석사

Background The underlying rationale of platelet rich plasma (PRP) therapy is that an injection of concentrated PRP at the site of injury may promote tissue repair via cytokine release from platelets. The molecular mechanisms of PRP therapy in the skin wound healing process are not well understood at present, and would benefit from clarification. Methods PRP was stimulated with angonists for 5 min, and cytokine profile analysis was performed. To investigate the wound healing activity of PRP, cell proliferation and migration analyses were performed in skin cells. The effects of PRP were analyzed on the expression and activity of matrix metalloproteinase (MMP)-1, -2, -9, and the activation of transcription factors. Results Thrombin was found to be a strong stimulator of PRP activation to release growth factors and chemokines. PRP induced cell proliferation and migration in HUVECs, HaCaT cells, and HDFs, as well as MMP-1and MMP-9 expression in HaCaT cells, but PRP did not have a significant effect on the expression or activity of MMPs in HDFs. The transcription factors, including signal transducer and activator of transcription- 3 (STAT-3) were found to be phosphorylated following PRP treatment in HaCaT cells. Conclusion In this study, we have identified the cytokine profile of activated PRP after agonist stimulation. We have shown that PRP plays an active role in promoting the proliferation and migration of skin cells via the regulation of MMPs, and this may be applicable to the future development of PRP therapeutics to enhance skin wound healing. Key Words : Platelet rich plasma (PRP), Wound healing, Cytokine profile, Cell proliferation, Cell migration, Matrix metalloproteinase 연구배경: 농축 혈소판(Platelet Rich Plasma, PRP)의 사이토카인 및 성장인자, 키모카인들에 의한 염증반응, 조직재생 및 상처치유의 기능은 현재 많은 주목을 받고 있다. 특히 상처치유의 과정에는 세포의 증식, 이동 및 세포외 기질의 합성과 분해에 의한 세포외 기질 재구성과 피부세포의 표피 재생성 등이 주요하게 작용하고 있다. 따라서 본 연구에서는 1) 각 길항제에 의한 농축 혈소판의 활성화에 따른 사이토카인과 성장인자들의 분비를 연구하고 2) 농축 혈소판에 의한 피부세포들의 이동, 증식 영향 및 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현 조절 연구 3) 농축 혈소판에 의한 MMP 발현 조절의 세포내 신호전달 체계에 대해 살펴보았다. 연구방법: 농축 혈소판(PRP)의 분리는 ACD tube에 혈액을 채취한 후 250 Xg, 15 min, 37℃ 에서 원심분리 하고 플라즈마 층만을 모아서 37℃에 10 분간 배양 후 1900 Xg, 8 min 37℃ 에서 원심 분리한다. 침전부분을 Washing buffer (Tyrode’s albumin solution) + 10 U/ml heparin + 0.5 uM PGI2를 넣은 후 침전을 풀어준 후 10 분간 37℃에서 배양 시키고 1900 Xg, 8 분간 37℃ 에서 원심분리 하여 혈소판을 모으고 혈소판 개수를 세어 실험에 사용한다. 농축 혈소판의 활성화 연구는 vwf, Ca2+ (%), Thrombin, collagen, ADP로 5분간 처리한 후 멀티플렉스 분석을 이용해 혈소판 내 사이토카인과 성장인자의 분포를 분석하였다. 농축 혈소판에 의한 세포이동 및 증식기전규명 연구를 위해 피부세포의 일종인 HaCaT 세포와 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast(HDF))를 10% DMEM에서 배양하여 이용하였다. PRP 처리에 의한 MMP의 발현조절 및 세포내 신호전달 체계는 10% 농축혈소판을 피부세포에 처리하고 웨스턴 블로팅 분석과 자이모그래피를 수행하여 확인하였다. 연구결과: 각 길항제에 의한 농축 혈소판의 활성화 효과는 트롬빈에서 PDGF와 TGF-β를 비롯한 성장인자와 사이토카인의 발출 비율이 높음을 알 수 있었다. 피부세포의 증식과 이동에 미치는 농축 혈소판 효과는 피부세포에서 유사한 비율로 세포의 증식과 이동을 증가시킴을 확인하였다. 또한 농축 혈소판 처리 시 피부세포에서 MMP-1의 발현이 증가함을 웨스턴 블로팅 분석을 통해 확인하였다. MMP-2, 9의 발현조절 연구는 자이모그래피를 수행하여 측정하였으며 역시 피부세포에서 MMP-9의 활성을 증가함을 알 수 있었다. 농축 혈소판에 의한 MMPs 발현과 활성에 관련 세포내 신호전달 체계에 대한 연구로 NF-kB, JNK, STAT-3의 활성이 주요하게 관련되어 있음을 확인하였다. 결론: 본 연구를 통해 농축 혈소판이 피부재생 및 상처치유에 주요하게 관여함을 확인하였고 메커니즘 연구로 피부세포에서 MMP-1, 9의 발현을 증가시킴으로 세포의 이동과 증식, 세포내 기질의 재구성에 관여함을 알 수 있었다.

(The) antidepressant-like effect of (2S,6S)-Hydroxynorketamine through adult hippocampal neurogenesis in mouse model of depression

손기영 한양대학교 의생명공학전문대학원 2021 국내석사

케타민의 주요 대사체인 (2S,6S)-hydroxynorketamine (HNK) 와 (2R,6R)-HNK 는 설치류 모델에서 케타민에 의해 생성되는 부작용 없이 빠르고 지속되는 항 우울 효과를 낸다고 보고 되었다. 그러나, (2S,6S)-HNK와 (2R,6R)-HNK 의 표적과 작용은 생화학적 수준에서 여전히 불분명하다. 본 연구에서, 케타민 대사체의 항 우울 효과와 성체 해마 신경 생성 사이의 잠재적인 연관성에 대하여 조사하였다. 면역 조직 화학 염색을 통해 신경 줄기 세포 (Neural progenitor cells) 의 증식이 (2S,6S)-HNK 와 (2R,6R)-HNK 모두에 의해 증가되었으나, 신경 줄기 세포의 생존 및 신경 성숙은 (2S,6S)-HNK 에 의해서는 증가하였으나 (2R,6R)-HNK에 의해서는 증가하지 않았다. 이러한 결과는 성체 해마 신경 생성에 있어 (2S,6S)-HNK 의 효과가 (2R,6R)-HNK 보다 더 잠재적이고 지속적인 것임을 시사하였다. 행동 분석을 통해 (2S,6S)-HNK 가 강제 수영 테스트 (Forced swim test) 에서 항 우울 행동 효과를 유도하였으며, 이러한 효과는 성체 해마 신경 생성을 동반하는 것으로 나타났다. 웨스턴 블롯 (Western blots) 을 통해서는 (2S,6S)-HNK 가 성체 마우스 해마에서 인산화된 calcuim/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) 와 cAMP response element-binding protein (CREB) 의 발현 및 brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 의 발현을 증가시켰다. 이러한 결과는 (2S,6S)-HNK 가 성체 해마 신경 생성의 촉진을 통해 항 우울 효과를 유도하고, CaMKII/CREB/BDNF 신호 경로가 (2S,6S)-HNK 의 항 우울 효과에 있어 관련이 있음을 시사한다. (2S,6S)-hydroxynorketamine (HNK) and (2R,6R)-HNK, the major metabolites of ketamine, have been reported to produce rapid and sustained antidepressant-like effects in rodent models without the side effects produced by ketamine. However, the targets and actions of (2S,6S)- and (2R,6R)-HNK are unclear at the biochemical level. In the present study, it was investigated that the potential link between antidepressant-like effects of ketamine metabolites and adult hippocampal neurogenesis. Immunohistochemical analysis revealed that proliferation of neural progenitor cells (NPCs) was increased by both (2S,6S)- and (2R,6R)-HNK, whereas neuronal maturation or survival of NPCs in the adult hippocampus was increased by (2S,6S)-HNK but not by (2R,6R)-HNK. These results suggested that the effects of (2S,6S)-HNK on adult hippocampal neurogenesis are more potent and longer-lasting than (2R,6R)-HNK. Behavioral analysis showed that (2S,6S)-HNK induced antidepressant-like behavioral effects in forced swim test (FST), and these effects were accompanied by adult hippocampal neurogenesis. Western blot analysis showed that (2S,6S)-HNK increased phosphorylation of calcuim/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and cAMP response element-binding protein (CREB) and expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the adult mouse hippocampus. Taken together, these results suggest that (2S,6S)-HNK induces antidepressant-like effects via promotion of adult hippocampal neurogenesis, and CaMKII/CREB/BDNF signaling is involved in the antidepressant-like effects of (2S,6S)-HNK.