Mangosteen 껍질 유래 γ-mangostin의 glutamate에 의한 HT22 신경세포 보호효과

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 신경세포 보호효과를 확인하기 위하여 흥분성 신경전달 물질로 알려진 glutamate의 과다분비로 인한 HT22 신경세포의 산화적 손상을 mangosteen 껍질의 한 성분인 γ-mangostin을 이용하여 항산화 효과 및 신경세포 보호효과를 확인하였다.

1. 항산화 효능을 확인하기 위하여 DPPH 소거능을 측정한 결과 γ-mangostin은 항산화제로 잘 알려진 N-acetyl cysteine보다 낮은 농도에서 항산화 효과를 나타내었다.

2. 신경세포 사멸억제 효과를 확인하기 위하여 5 mM glutamate를 처리하여 신경세포 사멸을 유도하였고, 해마 신경세포인 HT22 세포를 이용하여 N-acetyl cysteine과 세포생존율을 비교하였다. γ-Mangostin은 6.2 µM 이하에서 control과 비슷한 수치를 나타내어 glutamate로 인한 신경세포 생존율 감소를 효과적으로 억제함을 확인하였다.

3. 세포 내 산화적 스트레스를 유발하는 ROS 축적량을 형광 plate reader를 이용하여 형광강도를 측정한 결과 glutamate 처리로 증가된 세포 내 ROS 증가는 2.5 µM, 5 µM γ-mangostin의 처리로 인해 현저히 감소하였고, 형광 현미경 상에서도 그 변화를 확인하였다.

4. Heme oxygenase-1 발현을 Western blot에서 확인한 결과 γ-mangostin은 HO-1의 발현을 증가시켜 glutamate로 유도된 신경세포 사멸을 감소시키는 것을 확인하였다.

5. 세포 내 칼슘이온의 억제 효과를 확인하기 위하여 형광 인디케이터인 Fluo-4 AM을 염색하여 형광현미경 상에서 그 변화를 관찰한 결과 glutamate를 처리하였을 때 세포 내 칼슘이온이 증가하였으며, γ-mangostin이 glutamate에 의한 세포 내 칼슘이온 증가를 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다.

6. Apoptosis 억제 효과를 확인하기 위하여 Hoechst33342를 이용하여 chromatin 응축을 확인한 결과, glutamate에 의한 chromatin 응축이 증가하였으며, γ-mangostin이 chromatin 응축을 현저히 감소시켰다.

7. 세포사멸 유형을 분석한 결과, glutamate에 의한 apoptotic 세포사멸 마커인 Annexin V에 염색된 세포 비율이 증가하였고, γ-mangostin을 처리하였을 때, 이를 현저하게 감소함을 확인하였다.

8. Western blot을 진행한 결과, glutamate로 증가된 MAPK 인산화와 미토콘드리아 의존성 apoptotic pathway를 γ-mangostin이 억제함을 확인하였다.

9. 본 연구 결과 mangosteen의 껍질의 한 성분인 γ-mangostin은 항산화 효과뿐만 아니라 glutamate에 의한 apoptotic 세포사멸을 억제하는 효과를 보여줌으로써 퇴행성 뇌질환의 예방 가능성이 있을 것이라 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• List of Figures i
• 국문초록 iii
• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 4
• 1. 시료 및 시약 4
• 1) 시료 준비 4
• 2) 시약 및 기기 6
• 2. In vitro 항산화 실험 6
• 1) 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 소거능 측정 6
• 3. 신경세포 보호효과 측정 7
• 1) 세포 종류 및 세포 배양 7
• 2) 세포생존율 측정 7
• 3) 활성산소종 (Reactive Oxygen Species : ROS) 측정 8
• 4) 세포 내 칼슘이온(Ca2+) 농도 측정 8
• 5) Hoechst33342를 이용한 세포 내 chromatin 응축 관찰 8
• 6) Apoptosis 억제 효과 분석 8
• 7) 단백질 분리(Preparation of whole-cell extracts) 9
• 8) SDS-polyacrylamide gel 전기영동 및 Western blot analysis 9
• 4. 통계분석 10
• Ⅲ. 결과 및 고찰 11
• 1. γ-Mangostin의 항산화 효과 11
• 1) DPPH radical 소거 효과 11
• 2. HT22 신경세포 독성 억제 효과 13
• 1) 세포 독성 억제 효과 13
• 2) ROS 생성 억제 효과 16
• 3) 세포 내 Ca2+ 증가 억제 효과 20
• 4) Hoechst33342를 이용한 chromatin 응축 관찰 23
• 5) Apoptosis 유형 분석 25
• 6) Apoptosis 관련 단백질 발현 조절 28
• Ⅳ. 요약 및 결론 30
• References 32
• 영문초록 38