유전자 전달 시스템으로서 응용하기 위한 양이온 펩타이드가 결합된 수용성 키토산의 특성

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Recently, gene delivery has been designed by using various polymers and bioactive materials, and applied in the diverse fields, such as gene therapy and transfection reagent. Therefore, to develop a potent gene carrier with biocompatibility and biodegradability, there was designed water soluble chitosan (WSC) copolymers grafted with arginine, histidine, and lysine in monomer or octamer. The 1H-NMR spectra of copolymers showed a successful synthesis. The pDNA-binding capacities of coplymers were more enhanced than WSC and the size distributions of pDNA/copolymer polyplexes were ranged from 110 to 250 nm, approximately.
The free copolymers and polyplexes with pDNA were non-toxic against rat red blood cells and L929 cells. Interestingly, R8WSC, a octa-arginine peptide-grfted WSC, has the best transfection efficiency, compared to other copolymers and commercial transfection reagent.
Additionally, pDNA/R8WSC was transfected by macropinocytosis, energy, and clathrin clathrinmediated endocytosis.

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 유전자 전달체로 사용되는 물질인 키토산과 양이온성 아미노산을 이용하여 비바이러스성 유전자 전달체에 대한 연구를 진행 하고자 하였다.
양이온성 아미노산인 알지닌, 라이신, 히스티딘을 mono-형태와 octa-형태의 두가지 형태로 합성한 후 키토산에 결합하여 유전자 전달체를 제조 하였고 1HNMR을 이용하여 합성된 것을 확인 하였다. 유전자 전달체로 응용하기 위하여 유전자와 복합체를 형성하여 particle size를 측정 한 결과 100~300nm 의 크기를 형성하는 것을 확인 할 수 있었고, 유전자와의 결합 능력을 확인 하기 위하여 전기영동 실험을 한 결과 키토산은 1:4 비율에서 DNA와 복합체를 형성하며 1:16에서 완전한 복합체가 형성하는 것을 확인 할 수 있는 반면에 제조한 유전자 전달체는 1:4 이하에서 완전한 복합체를 형성 하는 것을 확인 할 수 있었다.
유전자 전달체로서의 요건 중 하나인 안정성을 확인 하기 위하여 복합체를 형성하기 전 sample과 유전자와 복합체를 형성한 sample의 용혈 현상과 세포 독성을 확인 한 결과 제조한 유전자 전달체는 기존 유전자 전달체로 사용되어지는 PEI 보다 낮은 용혈 현상과 세포독성이 거이 나타나지 않는 것을 확인 할 수 있었다.

제조된 유전자 전달체의 유전자 전이 효율을 분석 하기 위하여 green fluorescence protein이 발현 되는 pEGFP-N1을 이용하여 복합체를 형성한 후 여러세포 에서 비교하였다. 정상세포인 HEK293 cell에서는 mono-형태의 라이신과 알지닌이 결합된 복합체는 1:64, 1:8 비율부터 발현을 하기 시작하여 비율이 증가할수록 점점 많은 양의 세포가 발현하는 것을 확인 할 수 있었고 octa-형태의 알지닌, 라이신, 히스티딘이 결합된 복합체는 다른 결과를 보여 주었다. H8-WSC은 1:32 비율에서 적은 양의 세포가 발현하였고 1:64에서는 소폭 증가한 세포가 발현 하는 것을 확인 할 수 있었고, K8-WSC은 1:8에서부터 발현하기 시작해 비율이 증가할수록 많은 양의 protein이 발현 하는 것을 확인 할 수있었다. 또한 R8-WSC은 1:8비율부터 발현하기 시작하여 1:32에서는 대조군으로 사용되어진 Turbofect보다 많은 양의 protein이 발현 하였다. 동일한 실험 방법으로 암세포인 MCF-7 세포, DLD-1 세포, HCT 119 세포, B16F10 세포에서 유전자 전이 효율을 분석한 결과 약간의 차이를 보이긴 하지만 동일한 결과가 나타나는 것을 확인 하였다. 전달체의 endocytosis 메커니즘 실험에서 제조된 유전자 전달체는 microtubule-dependent, clathrin-mediated, energy dependent에 의하여 endocytosis가 일어나는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 바탕으로 하여 유전자와의 복합체 형성이 뛰어나고, 독성이 적으며, 유전자 전이 효율이 좋은 전달체를 제조하였다. 제조된 전달체는 유전자 전달체로서의 응용 가치가 있으며, 다양한 방법으로 활용 가능할 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• I. 일반적 서론 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥10
• 1.1. 유전자 치료 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥10
• 1.1.1. 유전자 치료의 정의 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥11
• 1.1.2. 유전자 치료의 원리 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥12
• 1.1.3. 유전자 치료의 문제점 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥13
• 1.2. 유전자 전달체로서 응용 가능한 고분자 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥14
• 1.2.1. PEI (Polyethyeneimine) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥16
• 1.2.2. PLL (Poly(L-lysine)) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥17
• 1.2.3. Chitosan ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥17
• 1.2.4. Dendrimer ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥18
• 1.3. 암세포의 특성 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19
• 1.4. 유전자 전달체 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥20
• 1.4.1. 바이러스성 전달체 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥21
• 1.4.1.1. 레트로바이러스 벡터 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22
• 1.4.1.2. 아데노바이러스 벡터 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥23
• 1.4.1.3. 아데노부속 벡터 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24
• 1.4.1.4. 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24
• 1.4.1.5. 렌티바이러스 벡터 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥25
• 1.4.2. 비바이러스성 전달체 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥25
• 1.4.2.1. 양이온성 지질 전달체 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥26
• 1.4.2.2. 양이온성 고분자 전달체 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27
• 1.5. 유전자 치료 및 전달에 대한 현황 및 응용 사례 ‥‥‥‥‥‥‥‥28
• II. 서론 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥30
• III. 재료 및 실험방법 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥32
• 2.1. 시약 재료 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥32
• 2.2. 세포 배양 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥33
• 2.3. R-, H-, L-WSC 와 R8-, H8-, L8-WSC 의 제조 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥33
• 2.4. 아미노산의 결합된 수용성 키토산의 구조 분석 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥33
• 2.5. Particle Size 측정 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥34
• 2.6. 전기영동장치를 이용한 복합체 형성 확인 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥34
• 2.7. 혈액 적합성 확인 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥34
• 2.8. 세포 독성 측정 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥35
• 2.9. 유전자 전달 효율 측정 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥35
• 2.10. Endocytosis 메커니즘 확인 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥36
• IV. 결과 및 고찰 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥38
• 3.1. Copolymer 의 구조분석 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥38
• 3.2. Particle Size 분석 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥41
• 3.3. 유전자와 복합체 형성 분석 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥43
• 3.4. 혈액 적합성 분석 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥45
• 3.5. 세포 독성 분석 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥47
• 3.6. 유전자 전이 효율 분석 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥49
• 3.7. Endocytic 메커니즘 분석 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥56
• V. 결 론 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥58
• VI. 참고문헌 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥59
• 요약 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥65
• List of Publication ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥67