Structural and Functional Characterization of TRPC1/4/5 Heteromers as a Sodium activated channel = TRPC1/4/5 헤테로머의 소듐 선택성을 중점으로 한 구조 및 기능적 특성

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Transient receptor potential canonical (TRPC) channels are nonselective cation channels that shape excitability and signaling across neuronal, cardiovascular, and visceral tissues. In native systems, TRPC1/4/5 family members are frequently expressed as heteromeric assemblies rather than isolated homomers, suggesting that assembly-dependent gating rules—not single-subunit properties—contribute to physiological channel identity. We therefore hypothesized that incorporation of TRPC1 into TRPC4/5-rich tetramers reconfigures intracellular ion coupling and GPCR/G-protein control through an intrinsically asymmetric heteromeric architecture.
We established expression conditions that favor heteromer formation and used concatemeric constructs with defined subunit arrangements to compare TRPC5 homomers with TRPC1 containing channels. Whole cell recordings showed a clear shift in ion dependence: TRPC5 homomers were strongly potentiated by intracellular Ca²⁺ and showed little response to intracellular Na⁺, whereas TRPC1–5 assemblies were activated by intracellular Na⁺ in the tens-of-millimolar range and exhibited weak Ca²⁺ dependent potentiation. A TRPC1–5/TRPC4–4 assembly retained Na⁺ dependent gating, but exhibited altered current–voltage relationships and modified sensitivity to pharmacological modulators, indicating that TRPC4 quantitatively tunes, rather than eliminates, TRPC1 dependent Na⁺ responsiveness.
To mechanistically interpret this assembly-dependent ion coupling, we interpreted our electrophysiological data in the context of available cryo-EM structures and our structure-informed mutational analyses. Rather than invoking a discrete intersubunit Na⁺ binding pocket, our results are most consistent with an allosteric model in which TRPC1 incorporation remodels intracellular coupling centered on the S2–S3 linker. This TRPC1-dependent coupling architecture differs from TRPC5 in a way that supports low affinity Na⁺ dependent modulation of gating while attenuating the Ca²⁺ dependent potentiation characteristic of TRPC5 homomers. Consistent with separable contributions of coupling versus permeation, pore-domain substitutions in TRPC1 altered conductance and activation profiles toward more TRPC5-like behavior without abolishing heteromeric expression.
Finally, we show that regulation of TRPC1 containing assemblies is strongly G protein subtype dependent. Constitutively active Gαi2 enhanced TRPC1–5 currents, whereas Gαq suppressed them, supporting a model in which heteromeric TRPC assemblies can act as direct G protein effectors in a manner determined by subunit composition. Together, these findings identify TRPC1 as an assembly dependent tuning subunit that converts TRPC4/5 channel logic from Ca²⁺ biased potentiation to Na⁺ responsive gating while imposing subtype selective G protein modulation. This dissertation provides a mechanistic framework for how TRPC heteromers integrate ionic homeostasis with receptor-coupled signaling, with implications for excitable cell physiology and therapeutic targeting of TRPC1/4/5 assemblies.

국문 초록 (Abstract)

Transient receptor potential canonical(TRPC) 채널은 비선택적 양이온 채널로서 신경계, 심혈관계, 내장 조직 전반에서 흥분성과 신호전달을 조절한다. 생체 조직에서 TRPC1/4/5 계열은 단독 호모머보다 이종복합체 형태로 존재하는 경우가 많으며, 이는 개별 서브유닛의 특성만으로는 설명되지 않는 조립-의존적 개폐 규칙이 생리적 채널 정체성에 기여함을 시사한다. 본 연구에서는 TRPC4/5가 우세한 사량체에 TRPC1이 포함될 때, 본질적으로 비대칭적인 이종복합체 구조를 통해 세포내 이온 결합과 GPCR/G 단백질 조절이 재구성된다는 가설을 설정하였다.
이를 검증하기 위해 이종복합체 형성을 유리하게 하는 발현 조건을 확립하고, 서브유닛 배열이 정의된 concatemer construct를 이용하여 TRPC5 호모머와 TRPC1 포함 채널을 비교하였다. Whole-cell 기록에서 이온 의존성이 명확히 전환됨을 확인하였는데, TRPC5 호모머는 세포내 Ca²⁺에 의해 강하게 증강되었고 세포내 Na⁺에는 거의 반응하지 않았던 반면, TRPC1–5 복합체는 수십 mM 범위의 세포내 Na⁺에 의해 활성화되었고 Ca²⁺ 의존적 증강은 약하게 나타났다. 또한 TRPC1–5/TRPC4–4 조립체는 Na⁺ 의존적 개폐 특성을 유지하면서도 정류 특성과 약리학적 반응이 달라, TRPC4가 TRPC1 의존적 Na⁺ 반응성을 조절하되 소실시키지는 않음을 시사하였다.
이러한 조립-의존적 이온 결합을 기전적으로 해석하기 위해, 전기생리학 결과를 기존 cryo-EM 구조 정보 및 구조적 근거를 바탕으로 한 돌연변이 분석과 함께 통합하였다. 단일한 서브유닛 경계면 Na⁺ 결합 포켓을 가정하기보다는, TRPC1의 도입이 S2–S3 linker를 중심으로 한 세포내 결합 구조를 재배열하여 알로스테릭 방식으로 개폐를 조절한다는 모델이 본 결과와 가장 일치하였다. 이러한 TRPC1-의존적 결합 구조는 TRPC5와 달리 낮은 친화도의 Na⁺ 의존적 개폐 조절을 가능하게 하는 동시에, TRPC5 호모머에서 특징적인 Ca²⁺ 의존적 증강을 약화시키는 것으로 해석된다. 또한 결합과 투과의 기여가 분리될 수 있음을 보여주듯, TRPC1의 pore-domain 치환은 이종복합체의 발현 자체를 유지한 채 전도 및 활성화 양상을 보다 TRPC5 유사한 방향으로 변화시켰다.
마지막으로, TRPC1 포함 조립체의 조절은 G 단백질 아형에 강하게 의존함을 확인하였다. 구성적 활성 형태의 Gαi2는 TRPC1–5 전류를 증가시킨 반면, Gαq는 이를 억제하였으며, 이는 이종복합체 TRPC 조립체가 서브유닛 구성에 의해 결정되는 방식으로 직접적인 G 단백질 효과로 작동할 수 있음을 지지한다. 종합하면, TRPC1은 TRPC4/5 채널의 논리를 Ca²⁺ 편향적 증강에서 Na⁺ 반응성 개폐로 전환시키는 조립-의존적 조절 서브유닛이며, 동시에 G 단백질 아형 선택적 조절을 부여한다. 본 학위논문은 TRPC 이종복합체가 이온 항상성과 수용체-연결 신호를 통합하는 기전을 제시하며, 흥분성 세포 생리와 TRPC1/4/5 조립체의 치료 표적화에 대한 기초적 틀을 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 9
• II. Methods 48
• III. Results 61
• IV. Discussion 114
• V. Bibliography 131
• VI. Abstract in Korean 143