사구식물 복원용 다기능 근권세균의 식물생장촉진능 및 환경스트레스 저항능 유도 = Plant growth promotion and environment stress resistance induction of sand dune plant by the multi-functional PGPR of the rhizosphere of coastal sand dune plants

국문 초록 (Abstract)

해안사구 지역은 해양생태계로부터 내륙생태계로 이행되어가는 생태적 이행대로서, 풍부한 생물다양성을 내재하고 있으며, 독특한 해안생태계를 이루고 있다. 이러한 해안사구는 퇴적물량을 조절하여 해안을 보호하고, 사구 고유생물의 서식지로서의 역할을 수행하고 있다. 또한 인간에게는 훌륭한 경관을 제공하여 쾌적한 휴식처가 되고 있다. 그러나 다양한 기능을 수행하고 있는 해안사구의 경우 현재 해수욕장, 해사채취, 도로 및 항만 건설 등과 같은 무분별한 개발과 지구온난화로 인한 해수면 상승과 같은 자연재해로 인하여 사구식생 및 해안사구 지형의 파괴, 해안침식과 같은 문제점이 발생하고 있으며, 이로 인하여 무한한 가치를 가지고 있는 해안사구가 회복할 수 없을 정도로 위협을 받고 있는 실정이다. 자연생태계는 스스로 치유, 복원하는 능력이 가장 강하고, 해안사구의 경우 인간의 힘에 의한 인위적인 훼손이 가장 큰 요인이므로 훼손된 사구식생 복원방법 중 가장 경제적이며 자연적인 방법은 자연적인 식생의 복원이다. 이러한 자연적인 식생의 복원을 위하여 미생물을 이용한다면 매우 경제적이며 효과적일 것이다. 근권미생물은 다양한 생태계에서 근권군서를 구성하고 있으며, 다양한 기능으로 공생관계를 가진다. 그리하여 사구식물근권미생물을 이용하여 점차 사라져가고 있는 해안사구복원을 위해 이용한다면 매우 효과적일 것이다.
균주분리를 위하여 경북 포항지역의 해안사구지역에서 서식하는 11종의 해안사구 식물의 근권으로부터 1,330종의 세균을 분리할 수 있었다. 이들 분리된 근권세균 중에서 생장촉진 호르몬 옥신과 지베렐린을 생산하며, 다양한 토양병원균에 대해 길항능을 가지는 23종의 균주를 선발할 수 있었다. 항진균성 기작 확인을 위하여 23균주에 대하여 기작조사를 하였으며 19균주가 항진균성 siderophore를, 4균주가 항진균성 β-glucanase를 생산하였다. 또한 13균주가 불용성 인산염 분해능을 가지고 있었으며, 1균주가 건조 및 염스트레스 완화물질 ACC deaminase를 생산할 수 있었다. 선발된 사구식물생장촉진 23균주들은 16S rDNA 염기서열 조사와 Bergey's manual에 의하여 99% 이상의 상동성을 가지는 Bacillus sp. 7균주와 Pseudomonas sp. 15균주들로 동정할 수 있었다. 이 중 옥신 및 지베렐린과 같은 식물생장촉진능, 인산가용화능, 식물병원균 길항능, ACC deaminase 생산능이 뛰어난 P. fluorescens IB4-14, P. aurantiaca IB5-8, IB5-10과 IB5-14를 최종적으로 선발하였다. 4종의 PGPR균주는 갯까치수영, 갯메꽃, 가는갯능쟁이, 갯완두의 종자발아촉진능 검증 결과 무처리구에 비하여 15% 이상 발아촉진능을 나타내었으며, in vivo 포트시험에서는 무처리구에 비하여 20%이상 높은 생장촉진능을 나타내었다. 또한 건조조건에서는 무처리구는 사멸하였지만 4종의 균주처리구의 경우 50일동안 50% 이상의 생존능을 나타내었다. P. aurantiaca IB5-10 과 IB5-14의 경우 HPLC와 GC-MS 분석결과 식물생장촉진호르몬인 ABA (abscisicacid), JA (jasmonicacid), zeatin (natural cytokinin)와 IPA (indole-3-propionicacid)를 생산하는 것으로 확인되었다. 그리고 P. aurantiaca IB5-10의 경우 5종의 지베렐린을 생산하였으며, P.aurantiaca IB5-14는 7종의 지베렐린을 생산하는 것으로 확인되었다. 또한 두 균주는 levan을 생산하는 것으로 확인되었다. 균주의 대량배양을 위하여 8L jar fermentor에서의 최적탄소원, 질소원, 온도, 배양속도, 공기주입량, pH, 배양시간을 조사한 결과 ammonium sulfate, molasses, 30℃, 200 rpm, 2.5 NI/min, pH 7.0, 20 hr 으로 조사되었다. 분말제제 제조를 위하여 최적 담체 선발한 결과 zeolite로 조사되었다. P. aurantiaca IB5-10과 IB5-14 의 분말제제의 경우 농진청이 고시한 온도안정성 조사에 따라 1년간 보증기간을 설정할 수 있었다. P. aurantiaca IB5-10과 IB5-14의 시제품을 갯메꽃과 갯까치수영, 갯쇠보리에 처리한 결과 무처리구에 반하여 30% 이상 높은 생장촉진능을 확인할 수 있었다. 또한 고온, 고염조건의 갯쇠보리시험구에서는 10일간 80%이상의 생존율을 확인할 수 있었다. 그리고 경북 포항의 화진해수욕장에서 in situ 시험을 실시한 결과 갯메꽃 무처리구에 반하여 35% 이상의 발아촉진능을 확인할 수 있었다.
이 결과 선발된 다기능 PGPR 균주가 다양한 환경스트레스조절과 식물생장촉진능을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며 이것은 다기능 PGPR균주는 파괴된 해안사구생태계 복원에 매우 용이하다고 생각된다. 이것은 친환경 생태계복원용 미생물제제로서 매우 기대가 된다고 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Coastal sand dune lies on the border between the sea and land. This area exhibits its own unique ecosystem owing to the combination of various organisms. It also serves as a storage area for groundwater, breakwater, and also as a recreational area for people. However, broad area of Korea's coastal sand dune is threatened by coastal erosion, desertification, overdevelopment and sea level rises caused by climate change. These adverse factors could result in the loss of sand dune plant habitats with the destruction of the coastal sand dune ecosystem. Rhizobacteria is the most important community in many ecosystems. It has a significant role within many coastal sand dune ecosystem cycles. Therefore, using sand dune plant rhizobabacteria is by far the most effective method in preventing the decrease in the sand dune plant ecosystem. In order to develop the multi-functional rhizobacteria that can exert a positive effect on the growth of plants growing in the coastal sand dune located along East Coast of Pohang, Korea, rhizobacteria of 11 different plants from this area were isolated 1,330 rhizobacteria. Among these, 23 strains were able to produce plant hormones such as auxin, gibberellic acid, and these had spectrum of antagonism toward various phytopathogenic microbes. To know the mechanism of this antifungal activity, these 23 strains were subjected to further analyses; 19 strains of these produced siderophore as determined by color reaction on CAS-blue plate, 4 strains produced antifungal β-glucanase as judged by color change on CMC-Congo red plate, 13 strains were able to utilized insoluble phosphate salts, also determined by clear zone formation on Pikovskaya medium. Identification of the strain was assigned to all 23 strains by 16s rDNA sequence analysed, and all were identified to be in the genus of Bacillus and Pseudomonas. Multi-functional PGPR P. fluorescens IB4-14, P. aurantiaca IB5-8, IB5-10 and IB5-14 were selected from 23strains. Four PGPR were selected based on their high production rate of auxin, gibberellic acid and insoluble phosphate solubilizing enzyme. One strain of these, denoted P. fluorescens IB4-14, showed ACC deaminase activity which is known to be involved in the resistance of environmental stress such as salt and drought. Four PGPR could stimulate the seed germination up to 15% on Lysimachia mauritiana (Maurit Loosestrife), Atriplex gmelini C. A. Meyer.(Hosoba-hama-akaza), Lathyrus japonica wild. (Beach Pea) and Calystegia soldanella (Sea Bindweed). When the pots were treated with the P. fluorescens IB4-14, P. aurantiaca IB5-8, IB5-10 and IB5-14 the growth of C. soldanella was over 20% higher than non-treatment. As the selected PGPR were treated on C. soldanella under the high drought condition, the stressed plant could survive up to 50% for 50 days. Among these, P. aurantiaca IB5-10 and IB5-14 could be verified production capacity of ABA (abscisic acid), JA (jasmonic acid), and zeatin (natural cytokinin) as plant growth regulating hormone as well as IPA (indole-3-propionicacid) by HPLC and GC-MS. And P. aurantiaca IB5-10 could be verified 5 kinds different of gibberellic acids. P.aurantiaca IB5-14 could be verified 7 kinds different of gibberellic acids by GC-MS. Also, Two strains could produce levan. The optimal carbon source, nitrogen source, temperature, agitation, aeration, pH and culture time for the P. aurantiaca IB5-10 and IB5-14 growth were ammonium sulfate, molasses, 30℃, 200 rpm, 2.5 NI/min, pH 7.0 and 20 hr in 8L jar fermentor. The optimal inorganic carriers for the P. aurantiaca IB5-10 and IB5-14 stablization were zeolite. Powder-type formulation of P. aurantiaca IB5-10 and IB5-14 could set up guaranteed for a year by improvement and standard of thermal stability test (Rural development administration, Korea). When the pots were treated with the P. aurantiaca IB5-10 and IB5-14 commercial pilot products the growth of C. soldanella, L. mauritiana and Ischaemum anthephoroides (Gramineae). were over 30% higher than those with non-treatment. Also, P. aurantiaca IB5-10 and IB5-14 commercial pilot products were treated on Ischaemum anthephoroides under the high drought and salt condition, the stressed plant could survive up to 80% for 10 days. When pilot products were treated on Imperata cylindrica var. koenigii. under the high drought and salt condition, the stressed plant could be survive up to 80% for 10 days and the seed germination of Calystegia soldanella was over 35% higher than non-treatment on the field test in Hwa-jin beach, Korea.
This research showed that the selected multi-functional PGPR have both plant growth promoting and environmental stresses resistance effects on sand dune plants. Therefore, this multi-functional PGPR will help to promotion of growth and germination rate in sand dune plants. That will make restoring damaged coastal sand dune ecosystem much easier. Also, it will be expected production of various biological control agents for environmental-friendly restoration of ecosystem.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 8
• 1. 해안사구 Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) 의 분리 8
• 2. 해안사구 PGPR의 선발 8
• 2.1. 옥신생산능 조사 8
• 2.2. 지베렐린생산능 조사 9
• 2.3. 인산가용화능 조사 10
• 2.4. 식물병원성 곰팡이의 길항 spectrum 10
• 2.5. 식물병원성 곰팡이 길항기작조사 10
• 2.6. 다양한 염농도에 해안사구 PGPR의 생장능 및 옥신생산능 조사 11
• 2.7. ACC deaminase 생산능 조사 11
• 2.8. 해안사구 PGPR 균주의 동정 11
• 3. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 생장촉진능 검증 12
• 3.1. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 식물생장촉진호르몬 특성 규명 및 정제 12
• 3.1.1. 옥신과 지베렐린 생산의 최적조건 조사 12
• 3.1.2. 다기능 해안사구 PGPR 균주가 생산하는 옥신의 추출 및 정제 12
• 3.1.3. 다기능 해안사구 PGPR이 생산하는 지베렐린의 정제 및 GC-MS 분석 14
• 3.1.4. 다기능 해안하구 PGPR이 생산하는 zeatin의 추출 및 정제 15
• 3.2. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 생장촉진능 검증 15
• 3.2.1. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 종자발아촉진능 검증 15
• 3.2.2. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 줄기 및 뿌리 생장촉진능 검증 16
• 4. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 환경스트레스 저항성 유도능 검증 17
• 4.1. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 스트레스 완화물질 특성 규명 17
• 4.1.1. 다기능 해안사구 PGPR이 생산하는 ABA의 추출 및 정제 17
• 4.1.2 다기능 해안사구 PGPR이 생산하는 JA의 추출 및 GC-MS 분석 17
• 4.1.3. 다기능 해안사구 PGPR의 스트레스 완화물질 Levan의 생산성 확인 18
• 4.2. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 건조스트레스 저항성 유도능 검증 19
• 5. 다기능 해안사구 PGPR의 제제화 및 실제사구 현장의 적용 19
• 5.1. 다기능 해안사구 PGPR 대량 배양용 배지 개발 19
• 5.1.1. 대량 배양용 배지 개발을 위한 최적 탄소원 및 질소원 조사 19
• 5.1.2. 상업용 대량배양을 위한 최적 생산조건 확립 20
• 5.1.3. 상업용 배지의 효과 검증 20
• 5.2. 다기능 해안사구 PGPR의 제제화 20
• 5.2.1. 액상 제제화 샘플의 제조 20
• 5.2.2. 분말 제제를 위한 최적 담체 선발 21
• 5.2.3. 분말 제제화 샘플의 제조 21
• 5.2.4. 액상 및 분말 제제의 안정성 조사 22
• 5.3. 사구식물 생장촉진 근권미생물제제의 실제 사구내 현장적용 23
• 5.3.1. In vivo pot 실험을 생장촉진능, 건조 및 염스트레스 저항유도능 검증 23
• 5.3.2. In situ 해안사구 토양내 발아촉진능 검증 23
• Ⅲ. 결 과 24
• 1. 해안사구 식물생장근권세균(PGPR)의 분리 24
• 2. 식물생장호르몬생산성 해안사구 PGPR의 선발 25
• 2.1. 옥신을 생산하는 해안사구 PGPR의 선발 25
• 2.2. 지베렐린을 생산하는 해안사구 PGPR의 선발 26
• 2.3. 사구식물 생장촉진호르몬 생산성 PGPR의 인산가용화능 조사 27
• 2.4. 사구식물 생장촉진물질 생산성 PGPR의 식물병원성 곰팡이의 길항범위(spectrum) 28
• 2.5. 사구식물 생장촉진호르몬 생산성 PGPR의 진균성 식물병원균에 대한 길항기작조사 32
• 2.6. 다양한 염농도에 따른 다기능 PGPR의 생장능 및 옥신생산능 조사 34
• 2.7. 건조 및 염스트레스 완화 물질 ACC deaminase 생산성 검토 36
• 2.8. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 동정 38
• 3. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 생장촉진능 검증 39
• 3.1. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 식물생장촉진호르몬 특성 규명 및 정제 39
• 3.1.1. 옥신과 지베렐린 생산의 최적조건 조사 39
• 3.1.2. 다기능 해안사구 PGPR 균주가 생산하는 옥신의 추출 및 정제 41
• 3.1.3. 다기능 PGPR 균주가 생산하는 지베렐린의 정제 및 조성비율 42
• 3.1.4. 다기능 PGPR이 생산하는 생장촉진물질 zeatin의 추출 및 정제 43
• 3.2. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 생장촉진능 검증 44
• 3.2.1. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 종자발아촉진능 검증 44
• 3.2.2. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 줄기 및 뿌리 생장촉진능 검증 47
• 4. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 환경스트레스 저항성 유도능 검증 50
• 4.1. 다기능 해안사구 PGPR 균주의 스트레스 완화물질 특성 규명 50
• 4.1.1. 다기능 해안사구 PGPR이 생산하는 내스트레스유도물질 ABA의 추출 및 정제 50
• 4.1.2. 다기능 PGPR이 생산하는 내스트레스유도물질 JA의 추출 및 GC-MS 분석 51
• 4.1.3. 다기능 해안사구 PGPR의 스트레스 완화물질 Levan의 생산성 확인 53
• 4.2. 다기능 PGPR의 건조스트레스 저항성 유도능 검증 57
• 5. 다기능 해안사구 PGPR의 제제화 및 실제사구 현장의 적용 60
• 5.1. 다기능 해안사구 PGPR 대량 배양용 배지 개발 60
• 5.1.1. 대량 배양용 배지 개발을 위한 최적 탄소원 및 질소원 조사 60
• 5.1.2. 상업용 대량배양을 위한 최적 생산조건 확립 63
• 5.1.3. 상업용 배지의 효과 검증 64
• 5.2. 다기능 해안사구 PGPR의 제제화 65
• 5.2.1. 액상 제제화 샘플의 제조 65
• 5.2.2. 분말 제제를 위한 최적 담체 선발 66
• 5.2.3. 분말 제제화 샘플의 제조 68
• 5.3. 다기능 PGPR 액상 및 분말 제제의 안정성 조사 69
• 5.3.1. 액상제제의 고온가학처리시 안정성 조사 69
• 5.3.2. 액상제제의 저온가학처리시 안정성 조사 72
• 5.3.3. 분말제제의 고온가학처리시 안정성 조사 73
• 5.3.4. 분말제제의 저온가학처리시 안정성 조사 76
• 5.4. 사구식물 생장촉진 근권미생물제제의 실제 사구내 현장적용 77
• 5.4.1. in vivo pot 실험을 통한 시제품의 사구식물생장촉진능 검증 77
• 5.4.2. In vivo pot 실험을 통한 시제품의 건조 및 염스트레스 저항 유도능 검증 83
• 5.4.3. In situ 해안사구현장 토양내 시용된 시제품의 발아촉진능 검증 85
• Ⅳ. 고 찰 89
• Ⅴ. 참고문헌 93
• Ⅵ. 영문요약 102