Enterococcus faecalis BRCA-5 가 생산하는 혈전용해 효소에 관한 연구 = (A) study on fibrinolytic enzyme produced by Enterococcus faecalis BRCA-5

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Enterococcus faecalis BRCA-5, which produces a fibrinolytic enzyme, was screened from a fermented-soybean sauce. The enzyme was purified from culture broth of E. faecalis BRCA-5 using the ammonium sulfate fraction and phenyl sepharose 6 Fast Flow chromatgraphy. The SDS-PAGE analysis revealed that the purified enzyme, named tempase, was found to have a molecular weight of 38 kDa. The enzyme displayed a very broad optimal pH and its pI value was 4.8. Tempase was easily inhibited by metal-chelating agents, but not by serine protease inhibitors, suggesting that the enzyme belongs to a member of metalloenzyme family. Among several human plasma proteins tested as possible substrates for the protease reaction, the tempase hydrolyzed specifically fibrin and fibrinogen without affecting other proteins such as serum albumin, plasminogen, plasmin, thrombin and urokinase. The N-terminal amino acid sequence of 19 residues, Val - Gly - Ser - Glu - Val - Thr - Leu - Lys - Asn - Ser - Phe - Gln - Val - Ala, had 98% homology with that of coccolysin(EC 3.4.24.30). The mature protein-coding region was amplifed by PCR and cloned into the pET22b vector, and the resulting plasmid was used to transform BL21(DE3) Escherichia coli cell. The gene encoding this tempase was cloned and sequenced. Culture of the transformants at 37℃ led to the overexpression of an insoluble and inactive 38 kDa protein after 1.0 mM IPTG induciton./

국문 초록 (Abstract)

혈전용해 활성이 우수한 균주를 분리하기 위하여 국내외 전통 발효식품 76종을 수집하여 fibrin plate method를 통한 혈전용해 활성을 탐색하였다. 그결과 발효식품 5종에서 혈전용해 활성을 가지는 균주 14종을 분리하였고 그 중 상대적으로 활성이 좋은 6종의 균주를 대상으로 한 실험을 통하여 최종적으로 혈전용해 우수 균주를 선정하였다. 선정된 균주는 형태학적, 생리학적, 분자생물학적 특성을 조사한 결과 Enterococcus faecalis로 동정되어 안전성이나 식품 공전의 허가사항 등에 매우 적합한 균주로 판명되었다. 이 균주는 M17배지에 1% glucose를 첨가한 배지에서 최대성장 및 최대 활성을 나타냈으며 혈전용해활성은 배양시간 2시간부터 균체생육과 동시에 급격히 증가하였다. 이 균주가 생산하는 혈전용해효소는 배양상등액으로 부터 ammonium sulfate 침전법, phenyl sepharose 6 fast flow로 분리·정제하였으며, 이 효소를 tempase라 명명하였다. Tempase는 50℃미만에서 최대활성을 나타내며, pH는 7.0-9.0에서 최적활성을 나타내었다. Protease inhibitor에 의한 효소활성억제 결과 EDTA에 의해 억제되어 metalloprotease로 판명되었다. 주요 혈장단백질에 대한 영향 조사결과 fibrinogen과 fibrin에만 특이적으로 반응한 것으로 판명되었다. Tempase의 N-terminal 아미노산 배열을 분석하여 19잔기의 아미노산 배열을 결정하였고, 이를 SWISS - PROT program을 통하여 분석한 결과 E. faecalis가 생산하는 coccolysin (EC 3.4.24.30)과 98%의 상동성을 나타내었다. 이 아미노산 배열부터 primer를 제작하여 E. faecalis BRCA-5 genomic DNA를 주형으로 PCR을 수행하였으며, DNA 염기서열을 결정, 분석하였다. PCR product를 pGEM T-easy vector를 이용 cloning 하고 이를 pET22b(+) expression vector에 lig