Chromohalobacter sp. HS-2 유래 수산화효소 유전자 내포 재조합 대장균을 이용한 hydroxybenzoate의 전환 = Bioconversion of hydroxybenzoate using recombinant E. coli harboring hydroxylase genes from Chromohalobacter sp. HS-2

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Chromohalobactersp. strain HS-2 was isolated from salted fermented clams and analyzed for the ability to grow on (hydroxy)benzoate as the sole carbon and energy source. HS-2 was characterized to be moderately halophilic, with an optimal NaCl concentration of 10%. The genes encoding the benzoate metabolism of HS-2 were cloned into a cosmid vector, sequenced, and then analyzed to reveal the benzoate dioxygenase (benABC), p-hydroxybenzoate hydroxylase gene (pobA) and m-hydroxybenzoate hydroxylase gene (mobA). The HS-2 genes involved in (hydroxy)benzoate degradation were clustered within approximately 39 kb region, and showed quite a different genetic organization from those of other benzoate catabolic genes. The benABC, pobA, mobA genes were cloned into the expression vector pEXP5-CT/TOPO. The expressed BenABC, PobA, MobA were analyzed by SDS-PAGE and the specific bands were confirmed. The HPLC and LC-MS/MS analysis revealed that resting cells of E. coli BL21 (DE3) harboring benABC, pobA, mobA oxidized 3-chlorobenzoate to 4-chlorocatechol, p-hydroxybenzoate to protocatechuate and m-hydroxybenzoate to protocatechuate, respectively. To enhance the conversion rate, pKJE7 chaperone (dnaK-dnaJ-grpE) were co-expressed with E. coli harboring pobA and mobA genes, respectively. The pobA and mobA genes expressed higher level of protein than without pKJE7. And bioconversion of high concentration of m, p-hydroxybenzoate to protocatechuate by co-expression of pobA with pKJE7.

목차 (Table of Contents)

• 제 1 장 서 론 1
• 1. 연구 배경 1
• 2. 연구 동향 3
• 3. 연구 목표 4
• 제 2 장 실험 재료 및 방법 10
• 제 1 절 실험 재료 10
• 1. 효소 및 시약 10
• 2. 사용 균주 및 플라스미드 10
• 3. 배지 조성 10
• 제 2 절 실험 방법 12
• 1. Chromosomal DNA extraction 12
• 2. Competent cell 제조 12
• 3. 플라스미드 DNA 분리 13
• 4. Aromacic oxygenase 유전자의 클로닝 14
• 1) Benzoate dioxygenase 유전자의 클로닝 14
• 가. benABC 유전자의 증폭 14
• 나. 제한효소 처리와 DNA 단편 분리 14
• 다. Ligation 15
• 라. benABC 유전자의 형질전환 15
• 마. 형질전환된 균체로부터 플라스미드 확인 15
• 2) p-hydroxybenzoate hydroxylase 유전자의 클로닝 15
• 가. pobA 유전자의 증폭 15
• 나. 제한효소 처리와 DNA 단편 분리 16
• 3) m-hydroxybenzoate hydroxylase 유전자 클로닝 16
• 가. mobA 유전자 증폭 16
• 나. 제한효소 처리와 DNA 단편 분리 16
• 5. 단백질 과발현 17
• 1) 단백질 과발현 유도 17
• 2) SDS-PAGE를 이용한 단백질 발현 확인 17
• 6. 재조합 대장균을 이용한 생물전환 18
• 7. HPLC에 의한 대사산물 분석 18
• 8. 재조합 대장균에서의 chaperone plasmid의 동시발현 18
• 1) 재조합 대장균에서의 chaperone plasmid의 동시발현 시스템 구축 18
• 2) L-arabinose의 농도에 따른 최적 과발현 조사 19
• 3) 단백질 과발현 유도 19
• 9. 효소 특성조사 20
• 1) PobA 단백질 정제 20
• 가. 초음파 파쇄기를 이용한 cell free extract의 제조 20
• 나. Ni-NTA column을 이용한 PobA 정제 20
• 다. PobA 단백질의 활성측정 20
• 제 3 장 결과 및 고찰 21
• 1. Aromatic oxygenase 유전자의 클로닝 21
• 2. benABC 유전자의 발현 및 생물전환 24
• 1) benABC 유전자의 발현 24
• 2) benABC 유전자를 이용한 생물전환 26
• 3. pobA 유전자의 발현 및 생물전환 28
• 1) pobA 유전자의 발현 28
• 2) pobA 유전자를 이용한 생물전환 30
• 4. mobA 유전자의 발현 및 생물전환 32
• 1) mobA 유전자의 발현 32
• 2) mobA 유전자를 이용한 생물전환 34
• 5. 재조합 대장균에서 chaperone plasmid의 동시발현 시스템 구축 36
• 6. pobA 유전자와 chaperone plasmid의 동시발현 및 생물전환 38
• 1) pobA 유전자와 chaperone plasmid의 동시발현 38
• 2) L-arabinose 농도가 동시발현에 미치는 영향 40
• 3) pobA와 pKJE7이 동시발현된 재조합 대장균을 이용한 생물전환 42
• 7. mobA 유전자와 chaperone plasmid의 동시발현 및 생물전환 44
• 1) mobA 유전자와 chaperone plasmid의 동시발현 44
• 2) L-arabinose 농도가 동시발현에 미치는 영향 46
• 3) mobA와 Chaperone plasmid가 동시발현된 재조합 대장균을 이용한 생물전환 48
• 8. Ni-NTA spin column을 이용한 pobA 유전자 정제 51
• 제 4 장 결 론 53
• 참고문헌 54