Partially purified oriental herbs inhibit melanogenesis in B16F10 cells = 부분 정제 약용식물 추출물의 멜라닌 생성억제

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 피부 멜라닌 생합성을 저해하는 물질을 천연물로부터 분리, 멜라닌 생성억제 기전을 규명하기 위하여 수행하였다.
천연물로부터 멜라닌 생성을 억제하는 물질을 찾고자, 문헌이나 민간에서 피부에 관련하여 사용되고 있는 31 종 약용식물의 미백 활성을 α-MSH 로 자극한 B16F10 mouse melanoma cell 에서 조사하였다. 스크리닝 결과 9 종 약용식물이 미백물질로서 높은 효과를 보였고, 그 중에서 세포독성이 없고 미백활성을 나타내는 승마, 울금, 세신 3개 약용식물을 선택하여 B16F10 mouse melanoma cell에서 멜라닌 생성억제 효과를 측정하고 그 기전에 대하여 조사하였다.
첫 번째, 승마의 dichloromethane 분획을 이용하여 B16F10 mouse melanoma cell에서 α-MSH 자극에 의한 멜라닌 생합성 저해 활성을 확인한 결과, positive control인 arbutin보다 높은 효과를 나타내었다. 또한, 세포내 tyrosinase 활성에 대한 억제도 대조군에 비해 차이를 보이고 있어 세포내 멜라닌 생성의 억제는 tyrosinase 활성의 억제를 통해 이루어졌음을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과가 멜라닌 생성에 관련된 단백질 발현과도 연관성이 있는지를 확인하기 위해 tyrosinase, TRP1, TRP2 및 전사인자인 MITF의 항체를 이용한 western blot으로 관련 단백질의 발현량 변화에 대하여 조사하였다. 그 결과 승마 추출물은 α-MSH 자극에 의해 유도된 멜라닌 생성에 관련된 단백질 발현을 저해하는 하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, α-MSH에 의해 자극된 B16 F10 mouse melanoma cell에서 승마 추출물은 ERK와 Akt의 활성화를 유도시키는 것을 확인할 수 있었다.
이는 승마 추출물이 α-MSH 자극에 의한 세포신호전달 경로 중 ERK 혹은 Akt의 활성화를 유도함으로써 멜라닌 생합성에 직접적으로 관여하는 효소인 MITF와 tyrosinase의 발현을 저해하는 것으로 사료된다.
두 번째, 울금으로부터 분리된 ethyl acetate의 80% MeOH ODS분획물을 이용하여 α-MSH에 의해 자극된 B16F10 mouse melanoma cell에서 멜라닌 생합성 저해 활성 및 tyrosinase활성을 관찰하였다. 그 결과 울금 추출물에서 tyrosinase 및 멜라닌 생합성에 관련된 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 α-MSH 자극을 준 세포와 자극을 주지 않은 세포에서 울금 추출물을 처리한 결과 멜라닌 생합성에 관련된 신호전달 경로인 MEK/ERK나 PI3K/Akt신호의 활성화가 관찰되었다.
α-MSH 자극에 의해 유도된 멜라닌 생합성에 있어서 울금 추출물의 저해효과는 MEK/ERK의 선택적인 차단제인 PD98059나 PI3K/Akt의 선택 적인 차단제인 LY294002에 의해서 저해효과가 감소되는 것이 관찰되었다.
이상의 결과에서 울금 추출물에 의한 MEK/ERK나 PI3K/Akt신호의 활성화가 멜라닌 생합성에 중요한 전사인자인 MITF와 멜라닌 생합성을 조절하는 tyrosinase 및 관련단백질(TRPs) 의 발현을 저해시킴으로서 멜라닌 생성을 저해시키는 것으로 사료된다.
세 번째, 세신으로부터 분리한 ethyl acetate의 60% MeOH ODS분획물을 이용하여 B16F10 mouse melanoma cell에서 멜라닌 생합성 저해 활성 및 tyrosinase 활성을 관찰 하였다. 멜라닌 생성에 영향을 미치는 다양한 촉진인자들에 의한 영향을 배제하기 위하여 앞선 실험과 달리 α-MSH 자극 없이 B16F10 mouse melanoma 세포에 세신 추출물을 처리하였다. 그 결과 세신 추출물은 농도 의존적으로 멜라닌 생합성과 tyrosinase의 활성을 저해하였다. 또한 세신 추출물이 tyrosinase, TRP1, TRP2 및 전사인자인 MITF의 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 세신 추출물이 멜라닌 생성에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하여 MITF와 tyrosinase의 mRNA 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.
또한 멜라닌 생성 관련 신호전달에 있어서 세신 추출물은 ERK신호를 활성화시켰으며, MEK/ERK의 선택적인 차단제인 PD98059에 의해서 활성 효과가 감소되는 것이 관찰되었다. 이상의 결과에서 세신 추출물은 ERK의 활성화를 유도하여 멜라닌 생합성에 중요한 전사인자인 MITF와 멜라닌 생합성을 조절하는 tyrosinase 및 관련단백질(TRPs) 의 발현을 저해시킴 으로써 멜라닌 생성을 억제시키는 것으로 사료된다.
이상의 연구 결과를 종합해 볼 때, 승마, 울금, 세신 추출물들은 B16 F10 mouse melanoma cell에서 멜라닌 생성과 tyrosinase활성을 모두 감소시키는 것으로 나타났으며, 특히 울금 추출물의 멜라닌 생성 억제효과가 가장 높게 나타났다. 또한 승마, 울금, 세신 추출물들은 MEK/ERK 나 PI3K/Akt 신호의 활성화를 통한 tyrosinase 및 관련단백질(TRPs)의 발현을 저해시킴으로써 멜라닌 생성을 저해시키는 것으로 사료된다. 이것은 기존의 멜라닌 생성억제 탐색법인 tyrosinase 활성억제 단계 보다 한 단계 더 앞선 경로과정을 확인함으로써, 향후 hypopigmentation효과에 보다 더 효율적으로 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• INTRODUCTION 1
• CHAPTER Ⅰ. Dichloromethane fraction of Cimicifuga heracleifolia decreases the level of melanin synthesis by activating the ERK or AKT signaling pathway in B16F10 cells 11
• 1. Introduction 11
• 2. Materials and methods 14
• 2.1. Preparation of CHE 14
• 2.2. Chemicals and antibodies 14
• 2.3. Cell culture 15
• 2.4. Mushroom tyrosinase activity assay 15
• 2.5. Cell viability assay 16
• 2.6. Measurement of cellular melanin contents 16
• 2.7. Tyrosinase activity assay 17
• 2.8. Western blot analysis 17
• 2.9. Statistical analysis 18
• 3. Results 20
• 3.1. Effect of CHE on cellular melanin synthesis and tyrosinase activity in B16F10 cells 20
• 3.2. Effect of CHE on melanogenesis pathways in B16F10 cells 23
• 3.3. Effect of CHE on inhibitory signaling pathways of melanogenesis in B16F10 cells 23
• 4. Discussion 28
• CHAPTER Ⅱ. Partially purified Curcuma longa inhibits α-MSH-stimulated melanogenesis through ERK or Akt activation-mediated signaling in B16F10 cells 32
• 1. Introduction 32
• 2. Materials and methods 35
• 2.1. Preparation of PPC 35
• 2.2. Chemicals and antibodies 36
• 2.3. Cell culture 36
• 2.4. Cell viability assay 36
• 2.5. Measurement of cellular melanin contents 37
• 2.6. Tyrosinase activity assay 37
• 2.7. Western blot analysis 38
• 2.8. Statistical analysis 38
• 3. Results 40
• 3.1. Effect of PPC on melanin biosynthesis and tyrosinase activity 40
• 3.2. Effect of PPC on melanogenesis pathways 43
• 3.3. Effect of PPC on inhibitory signaling pathways of melanogenesis 43
• 3.4. Effect of specific inhibitor on the suppressive mechanism of PPC 46
• 4. Discussion 49
• CHAPTER Ⅲ. Partially purified Asiasari radix inhibits melanogenesis through extracellular signal-regulated kinase signaling in B16F10 cells 52
• 1. Introduction 52
• 2. Materials and methods 55
• 2.1. Preparation of PPAR 55
• 2.2. Materials 56
• 2.3. Cell culture 56
• 2.4. MTT assay 56
• 2.5. Determination of the melanin content 57
• 2.6. Measurement of tyrosinase activity 57
• 2.7. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 58
• 2.8. Western blot analysis 58
• 2.9. Statistical analysis 59
• 3. Results 61
• 3.1. Effects of PPAR on melanin biosynthesis and tyrosinase activity 61
• 3.2. Effect of PPAR on the expression of melanogenic proteins and mRNA 61
• 3.3. Effect of PPAR on melanogenesis-related signaling pathways 65
• 3.4. Effect of PD98059 on the suppressive mechanism of PPAR 65
• 4. Discussion 70
• SUMMARY 74
• REFERENCES 78
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