Construction of the glyco-engineered Saccharomyces cerevisiae without mannosylphosphorylation

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Saccharomyces cerevisiae is a traditional yeast that is a well-established eukaryotic model system and was the first eukaryotic organism whose genome was sequenced. This yeast has been widely used for the recombinant protein expression (Romanos et al. 1992). Mannsoylphosphorylated glycans are found in fungi including yeast, and the removal of mannosylphosphates from glycans is a prerequisite for yeast glyco-engineering to produce human-compatible glycoproteins. The MNN4 and the MNN6 genes have been known to play important roles in mannosylphosphorylation in the traditional yeast Saccharomyces cerevisiae, but disruption of these genes did not completely remove the mannosylphosphates in N-glycans. This study was performed to find unknown key gene(s) involved in N-glycan mannosylphosphorylation in S. cerevisiae. For this purpose, I constructed the quadruple-disrupted och1Δmnn1Δmnn4Δmnn6Δ strain by disrupting MNN4 and MNN6 genes from the och1Δmnn1Δ strain in which yeast-specific hyper-mannosylated glycan and immunogenic (1,3)-mannose structures were already abolished. However, yeast-specific mannosylphosphorylated N-glycan structures were still observed in the och1Δmnn1Δmnn4Δmnn6Δ strain, which suggests that there is another unknown gene involved in mannosylphosphorylation. From the och1Δmnn1Δmnn4Δmnn6Δ strain, I further disrupted the genes (MNN14, YUR1, KTR2, KTR4, KTR5, or KTR7) having homology with MNN4 or MNN6 genes. Analyses of N-glycans obtained from cell wall mannoproteins of six quintuple-disrupted strains showed that mannosylphosphorylated glycan structure was completely abolished only in the och1Δmnn1Δmnn4Δmnn6Δmnn14Δ strain, indicating that MNN14 gene, a MNN4 paralog with unknown function, is essential for mannosylphosphorylation. Moreover, it was found that double disruption of MNN4 and MNN14 genes was enough to eliminate N-glycan mannosylphosphorylation. Further, I also showed that either MNN4 or MNN14 gene expression restored mannosylphosphorylation in the quadruple-disrupted och1Δmnn1Δmnn4Δmnn14Δ strain, which supports that MNN4 and MNN14 can play a redundant role for mannosylphosphorylation. My results suggest that the och1Δmnn1Δmnn4Δmnn14Δ strain, in which all yeast-specific N-glycan structures including mannosylphosphorylation were abolished, may have a promise as an useful platform for glyco-engineering to produce therapeutic glycoproteins with human-compatible N-glycans.

국문 초록 (Abstract)

출아 효모인 Saccharomyces cerevisiae는 전통 효모로서 분자 유전 기술을 다루기 쉬운 진핵 세포 모델이며, 진핵 생물로는 처음으로 전체 염색체 서열이 밝혀지고, 생리학적 측면에서 많은 연구들이 현재까지 이루어 지고 있다. 또한, 목적 단백질을 생산 하기 위한 단백질 발현 효모로써 가장 널리 사용되고 있다.(Romanos et al.1992) 만노오스 인산화 당사슬은 효모를 포함한 균류에서만 발견되며, 당사슬로부터 만노오스 인산화를 제거하는 것은 효모의 당사슬 엔지니어링이 인간과 친화적인 당 단백질을 생산하기 위한 전제조건이다. MNN4와 MNN6 유전자는 전통적인 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 만노오스인산화에 필요 하지만 이 유전자를 파괴해도 N-당사슬에서 만노오스 인산화가 완전히 제거되지는 않습니다. 이 연구는 S. cerevisiae에서 N-당사슬 만노오스 인산화에 관여하는 알려지지 않은 주요 유전자를 찾기 위해 수행되었다. 이를 위해 효모 특이적 만노오스화 당사슬과 면역원성 α(1,3)-만노오스 구조가 이미 파쇄된 och1Δmnn1Δ 균주에서 MNN4와 MNN6 유전자를 파괴시킴으로써 4 중 파쇄 och1Δmnn1Δmnn4Δmnn6Δ 균주를 구축 하였다. 그러나 och1Δmnn1Δmnn4Δmnn6Δ 균주에서는 효모특이성 만노오스 인산화된 N-당사슬 구조가 여전히 관찰되었으며 만노오스 인산화와 관련된 또 다른 유전자가 있음을 시사한다. och1Δmnn1Δmnn4Δmnn6Δ 균주로부터, 우리는 MNN4 또는 MNN6 유전자와 상동성을 갖는 유전자 (MNN14, YUR1, KTR2, KTR4, KTR5 또는 KTR7)를 추가로 파괴시켰다.6개의 유전자를 결손한 균주의 세포벽 만노오스 단백질로부터 얻어진 N-당사슬의 분석은 만노오스 인산화 당사슬 구조가 모두 제거된 och1Δmnn1Δmnn4Δmnn6Δmnn14Δ 균주에서만 나타냈다. 세포벽 만노오스 단백질과 돌연변이체에서 생산된 분비 재조합 단백질의 N-당사슬 프로파일 분석은 MNN14 유전자가 기능이 알려지지 않은 MNN4 유전자가 N-당사슬 만노오스 인산화에 필수적이라는 것을 보여 주었다. MNN4와 MNN14 유전자의 이중 파쇄는 N-당사슬 만노오스 인산화를 파쇄시키기에 충분했다. 하나의 유전자(MNN4 또는 MNN14)의 보완은 MNN4 및 MNN14가 하나의 유전자의 결손에 여분의 역할을 할 수 있음을 지지하는 och1Δmnn1Δmnn4Δmnn14Δ 균주에서 만노오스 인산화를 회복시켰다. 이러한 결과는 만노오스 인산화를 포함한 모든 효모 특이적인 N-당사슬 구조가 파쇄된 S. cerevisiae och1Δmnn1Δmnn4Δmnn14Δ 균주가 인간형 N-당사슬을 제작하여, 치료용 당 단백질을 생산하기위한 glyco-engineering을위한 유용한 플랫폼으로 기대할 수 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• ABSTRACT ......................................................................................................................................... 6
• 1. INTRODUCTION ........................................................................................................................ 9
• 2. MATERIALS AND METHODS ........................................................................................... 12
• 2.1. Yeast strains, media, and growth conditions ................................................ 12
• 2.1.1. Transformation of S. cerevisiae yeast ....................................................... 12
• 2.1.2. Disruption of target genes .............................................................................. 13
• 2.2. Recombinant protein expression and purification ..................................... 21
• 2.2.1. Construction of recombinant protein expression vectors ............. 21
• 2.2.2. Purification of recombinant Gas1 protein .............................................. 22
• 2.2.3. Isoelectric focusing (IEF) analysis ................................................................ 22
• 2.3 Yeast N-glycan analysis .............................................................................................. 26
• 2.3.1. N-Glycan preparation from cell wall mannoproteins (CWMs) .... 26
• 2.3.2. Glycan analysis using a DNA sequencer .................................................. 26
• 2.3.3 High performance liquid chromatography (HPLC) analysis ........... 27
• 2.4 Alcian blue staining ....................................................................................................... 28
• 3. RESULTS ...................................................................................................................................... 29
• 3.1. Simultaneous disruption of MNN4 and MNN6 cannot abolish N-glycan monnosylphosphorylation in S. cerevisiae ............................................... 29
• 3.2. MNN14, a paralog of MNN4, is a key gene involved in N-glycan mannosylphosphorylation ................................................................................................. 35
• 3.3. Alcian blue staining shows dominant role of MNN6 gene in mannosylphopshorylation of the outer sugar chains on S. cerevisiae cell surface .......................................................................................................................................... 43
• 3.4. MNN14 and MNN4 have a partially redundant function in N-glycan mannosylphosphorylation ................................................................................................. 47
• 3.5. N-glycan analysis of a secreted glycoprotein confirms the role of MNN14 in N-glycan mannosylphosphorylation .................................................... 50
• 4. DISCUSSION.............................................................................................................................. 55
• 5. REFERENCES .............................................................................................................................. 59