The strategy for human skin homeostasis through regulation of melanogenesis and lipolysis = 색소형성 및 지방분해 조절을 통한 피부 항상성 조절 전략

국문 초록 (Abstract)

인체의 기관 중 가장 바깥에서 다양한 외부요인으로부터 내부를 보호하는 첫 번째 관문으로 알려져 있는 피부는, 외부로부터의 변화에 항상 동일한 상태, 즉 항상성을 유지해야만 하는 기관으로 잘 알려져 있다. 피부는 매우 다양한 세포들로 구성되어 있는데, 가장 외부를 담당하는 각질형성세포(keratinocyte)부터, 피부의 구조를 담당하는 섬유아세포(fibroblast), 멜라닌을 합성 후 최외각 각질형성 세포로 전달하는 미백세포(mealnocyte), 그리고 지방세포로 구성된 피하지방층(subcutaneous fat) 등이 존재하는 것으로 보고되어 있다. 결국, 피부는 각각의 개별 기능을 가진 다양한 세포들이 적절한 구성비와 특별한 조건을 가지고 인체의 가장 외각에서 보호자 역할을 담당하고 있다.
이 중 미백세포(melanocytes)는 멜라닌(melanin)이라는 성분을 생성, 태양으로부터 오는 자외선에 의한 자극을 인체내부로 들어오지 못하도록 보호 역할을 담당하는 것으로 잘 알려져 있다. 이미 많은 연구를 통하여, 자외선은 피부에 직접적으로 악영향을 제공함과 동시에 경우에 따라 암을 유발하는 원인으로 작용함이 잘 알려져 있고, 이를 차단하기 위한 다양한 피부학적 접근이 많이 존재하는 것도 보고되어 있다. 그럼에도 불구하고, 자외선을 차단하기 위한 미백세포의 근원적인 멜라닌 생성 기능과 달리, 최근에는 많은 다양한 이유로 멜라닌이 비정상적으로 과도하게 생성, 미백세포 본연의 기능을 하지 못하는 것이 보고 되고 있지만 아직까지 근본적인 원인이 밝혀진 바가 거의 없다.
첫 번째 장에서 다루고자 하는 내용은, 내인성 인자에 의한 미백세포 내에서의 과색소 형성 및 그와 관련된 기작에 관한 내용이다. 인체는 상처 치유과정상 알 수 없는 원인으로 인해 상처부위나 그 주변이 색소침착 혹은 탈색이 일어나는 경우가 종종 보고되고 있다. 하지만, 어떠한 원인 및 기작에 근거하여 이러한 색소 불균형이 초래되는지 보고된 바가 없다. 본문에서 언급하는 Substance P (SP)는 상처치유 초기 과정에서 발생하는 상처치유 개시물질로 잘 알려져 있으며, 물리적, 정신적 불균형으로부터 야기 되는 다양한 스트레스의 원인으로도 보고되어 있다. 이러한 SP의 미백세포내 기작을 통한 피부 색소 과형성 과정 및 관련 신호전달 체계를 밝혀 피부 항상성 유지를 첫 번째 전략을 제안 하고자 한다. 본 연구에서는 미백세포에 인위적으로 SP를 처리한 결과에 따르면, SP를 받아들이는 수용체(neurokinin 1 receptor, NK1R)가 미백세포에 존재하며, 수용체를 매개로 활성화된 하위 시그널의 연속적인 조절을 통해 스스로 멜라닌 생합성을 촉진 시킬 수 있음을 본실험을 통해 밝혔다. 특히, 실험 결과에 따르면 미백세포에서 내인성 인자인 SP 유도에 의해 (스트레스 같은 조건) SP-NK1R-endothelin 1(EDN1)-endothelin receptor type B (EDNRB)의 일련의 신호전달체계가 정상의 경우보다 더욱 빠르게 멜라닌 생합성을 촉진, 피부를 어둡게 할 수 있음을 증명하였고, 이 연구 결과를 통해 자외선 같은 외부 요인뿐만 아니라 SP와 같은 내부 요인에 의해서도 멜라닌의 합성은 자극되어 피부 색소 항상성 유지에 변화를 초래할 수 있음을 확인하였다.
두 번째 장에서 다루고자 하는 내용은 진피층 밑에 존재하는 피하지방 조절에 관한 것이다. 최근까지, 지방에 관한 연구 대부분은 내장지방(visceral fat)에 관한 연구가 대다수를 차지하였으며, 피하지방(subcutaneous fat, SCF)에 대한 연구는 거의 밝혀진 바가 없었다. 하지만, 최근 줄기세포에 관한 연구가 각광을 받음과 동시에, 두피에서 모발 생성시 중요한 요소인 bulge stem cell의 존재에 피하지방이 매우 중요한 역할을 하고 있음이 밝혀지면서 피하지방의 존재가 더욱 중요하게 부각되었다. 더불어, 추가적인 연구를 통해 피하지방은 인체의 내장지방과는 작용 및 기능에서 서로 다른 부분이 있음이 점차 밝혀지고 있는 추세이다. 이러한 피하지방은 노화가 지속됨에 따라 내장지방과 같이 지방을 축척하는 역할을 담당하는 것뿐 아니라, 셀룰라이트(cellulite) 형성을 상승시켜, 피부의 형태 및 그 기능에 불균형을 초래하는 것으로 보고되고 있다. 하지만, 이러한 지방을 제거하기 위하여 레이저를 포함한 다양한 물리적 시술 방법이 존재함에도 불구하고, 적용에 상당한 제약 및 부작용이 존재하는 것이 이미 잘 알려져 있기에 새로운 접근법이 필요한 상황이다. 본 연구에서는 기존 시술과 달리 가시광선 영역의 특정 파장을 이용하면 피하지방 세포의 지방 분해를 가속화할 수 있음을 확인하였다. 더불어, 관련된 일련의 기작 검증을 통해 향후 새로운 지방조절 방법을 알림과 동시에 내장지방 과형성으로 야기될 수 있는 피부 구조의 불균형을 조절할 가능성을 확인하였다.
앞선 두 가지 연구 결과를 고려한 결과, 피부 항상성을 유지하기 위한 전략은 피부를 구성하는 각 세포의 특성을 파악함과 더불어 다양한 내,외부 요인들간의 관계를 명확히 규명하는 것이 선행되어야 한다고 판단된다. 따라서, 본 연구에서 언급하는 인체 피부항상성 유지를 위한 두 가지 전략은 임상학적 접근의 매력이 있음에도 불구하고, 아직까지는 관련된 더 많은 연구가 선행되어야만 한다. 특히, 안전성 및 정확도가 확보되고 이를 적용하기 위한 기준을 밝혀야만 본 연구는 보다 가치가 있을 것으로 판단된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The skin is the first line of defense protecting our body from various external factors (e.g., pathogens, excessive water loss) and it has a crucial role in maintaining homeostasis to prevent fluctuations caused by environmental changes outside of the body. The skin consists of various layers, which include many types of cells such as keratinocytes (KCs), fibroblasts (FBs), melanocytes (MCs) and subcutaneous fats (SCFs). In spite of their different functions, these cells can communicate and orchestrate complementarily to regulate homeostasis. For example, melanin is first produced by endo/-exogenous factors and then transported from MCs to KCs, resulting in the prevention of DNA damage in KCs through the absorption of ultraviolet (UV). However, excess amounts of melanin, which is mainly associated with most pigment disorders (e.g., hyperpigmentation) is aesthetically unpleasant and causes melanoma, skin cancer. In particular, excess amounts of melanin derived from endogenous factors can impair the functions of MCs according to previous literatures. However, fundamental causes have not been elucidated.
The first chapter focuses on hyperpigmentation and –related mechanisms mainly induced by endogenous factors such as substance P (SP) in MCs. SP is well-known for triggering the initial stage of wound healing and it is also a causative substance for psychological stress. It has been reported that abnormal pigmentation (e.g., hyper- or hypopigmentation) often occurs in injury lesions or areas surrounding the human skin during the wound healing process. However, the mechanisms underlying imbalanced pigmentations have not been elucidated. Therefore, I first attempted to investigate the mechanism of SP-related pigmentation including hyperpigmentation and concomitant signaling pathways in MCs and devised a strategy to maintain homeostasis of the skin. To do so, MCs were treated with SP and the underlying mechanisms of SP related pigmentation were investigated. Based on our results, I found that SP receptors (neurokinin 1 receptor, NK1R) were expressed on MCs and verified that melanin synthesis was promoted and regulated by NK1R receptor-dependent down-stream signaling pathways. These results showed that SP-NK1R-endothelin 1 (EDN1)-endothelin receptor type B (EDNRB) signaling can induce skin darkening through promoting melanin biosynthesis, which is much faster than the normal signal delivery system (e.g., stress conditions) by inducing SP.
In the second chapter, we discussed about controlling the lipolysis process using visible radiation in SCFs, which exists under the dermis layer of the skin. Until recently, studies on fat have focused on visceral fat research, and limited studies were conducted on SCFs. However, recent reports on SCFs highlighted the importance of maintenance of bulge stem cells during the hair growth process in human scalp, while stem cell research took place in the spotlight concurrently. Additionally, further investigative studies revealed that there is different interaction between the internal mechanism and its function from further SCFs investigation studies. The SCFs are not only responsible for the formation of fat with age, but also causes dyslipidemia accumulation/formation of cellulite, which is well known causative factor for asymmetry in the shape and related dysfunction of the skin. Although a variety of physical procedures, including laser therapy to eliminate the cellulite has been developed, new approaches are required because significant limitations and adverse side effects were reported. In this chapter, I confirmed that a specific wavelength in the visible radiation (VR) can induce specific light receptor, rhodopsin, and -related downstream signals can promote cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-dependent lipolysis pathway via activation of 3-adrenergic receptor in SCFs under the skin. As a result, we propose a second strategy to maintain the skin's homeostasis through a new method of lipid regulation via the series of relevant mechanisms mentioned above. Based on two previous studies, strategies for maintaining skin homeostasis should be designed by understanding the characteristics of each cell type that constitutes the skin, as well as establishing a clear relationship between various internal and external factors. Therefore, additional studies should still be preceded by a more relevant study, although two strategies for maintaining the homeostasis of human skin refer to the attractive results of the clinical approach. Especially, these studies are deemed to be more valuable whenever safety and accuracy has been confirmed and the criterion for its application is established. Therefore, I expect to pursue a deeper and more efficient skin homeostasis strategy based on these prior studies

목차 (Table of Contents)

• Summery 1
• Review of Literature: The role of melanocytes and subcutaneous fat for human skin homeostasis 5
• 1. Abstract 6
• 2. Introduction 7
• 3. The role of pigmentation in skin homeostasis 12
• 3.1. Melanocytes 13
• 3.2. Hyper- and hypopigmentation 14
• 3.3. Skin Cancer, melanoma 15
• 4. The role of hypodermis in skin homeostasis 17
• 4.1. Subcutaneous Fat 18
• 4.2. Cellulite 18
• 4.3. Liposuction 19
• 5. Conclusion and perspectives 21
• Chapter I. Substance P stimulates endothelin 1 secretion via endothelia-converting enzyme 1 and promotes melanogenesis in human melanocytes 22
• 1. Abstract 23
• 2. Introduction 25
• 3. Materials and Methods 28
• 3.1. Cell culture 28
• 3.2. Melanin content determination 29
• 3.3. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) 29
• 3.4. Western blot analysis 30
• 3.5. ELISA assay for secreted Endothelia 1 31
• 3.6. cAMP assay 32
• 3.7. Small interfering RNA (siRNA) assay 32
• 3.8. Reagents 33
• 3.9. Cell viability assay 33
• 3.10. Tyrosinase activity assay 33
• 3.11. Statistical analysis 34
• 4. Results 36
• 4.1. Substance P increases pigmentation in human melanocytes 36
• 4.2. Substance P stimulates the expression of pigmentation-related genes 42
• 4.3. Substance P up-regulates the expression of NK1R, EDN1, and EDNRB in addition to EDN1 secretion 44
• 4.4. The NK1R-ECE1-EDN1-EDNRB signaling cascade is involved in SP-induced pigmentation 48
• 4.5. Substance P increases the intracellular cAMP level and activates melanogenesis-related phosphorylation signaling 54
• 4.6. Substance P increases the melanin production in a reconstructed human skin model 58
• 5. Discussion 60
• Chapter II. Specific visible radiation facilitates lipolysis in mature 3T3-L1 adipocytes via rhodopsin-dependent β3-adrenergic signaling 65
• 1. Abstract 66
• 2. Introduction 68
• 3. Materials and Methods 71
• 3.1. Cell culture and differentiation 71
• 3.2. Visible radiation 71
• 3.3. Determination of the glycerol content 72
• 3.4. Oil Red O staining 73
• 3.5. Analysis of the total glycerol content 73
• 3.6. cAMP assay 74
• 3.7. Western blot analysis 74
• 3.8. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) 75
• 3.9. Small interfering RNA (siRNA) assay 76
• 3.10. Chemical reagents 76
• 3.11. Statistical analysis 77
• 4. Results 79
• 4.1. VR at specific wavelengths stimulates lipolysis in differentiated 3T3-L1 adipocytes 79
• 4.2. VR increases the levels of cAMP and phosphorylated hormone-sensitive lipase 83
• 4.3. The photoreceptor rhodopsin is expressed in 3T3-L1 adipocytes and is involved in VR-induced lipolysis 86
• 4.4. β3-AR is selectively induced by VR and mediates VR-induced lipolysis 91
• 4.5. VR induces β3-AR expression in a rhodopsin-dependent and cAMP-independent manner 94
• 4.6. VR-mediated down-regulation of the cGMP-PKG pathway contributes to the stimulation of cAMP-PKA signaling 99
• 5. Discussion 104
• References 110
• 논문요약 (국문) 129