TRPC 채널의 비대칭적 이종사합체의 생물리학적 구조-기능 분석 및 동종사합체의 구조 기반 약리학적 조절기전 연구 = Structure-function analysis of asymmetric TRPC heterotetramers and structure-based investigation of pharmacological regulatory mechanisms in TRPC homotetramers

국문 초록 (Abstract)

일시적 수용체 전위 정형군 (transient receptor potential canonical, TRPC) 채널은 칼슘 신호 매개 등 다양한 생리학적 기능을 한다. 서로 다른 TRPC 아형 간의 이종사합체(heterotetramer) 형성은 동종사합체(homotetramer)와 구별되는 기능적 다양성을 부여하며 관련 질병 치료의 중요한 표적이 된다. 그러나 TRPC 이종사합체의 정확한 분자 구조, 이온 투과도 조절 원리, 그리고 아형 특이적 약물 작용 기전에 대한 이해는 부족하다.

본 연구는 동결 시료 전자 현미경(cryo-electron microscopy, cryo-EM) 촬영 기법을 활용해 TRPC1/C4 및 TRPC1/C5 이종사합체의 3차원 구조를 최초로 규명하고, 하나의 TRPC1과 세 개의 TRPC4 또는 세 개의 TRPC5로 구성된 1:3의 비대칭적 화학양론 구성비를 밝혀냈다. FRET(Forster resonance energy transfer) 측정, 팻취 클램프(patch clamp) 전류 기록 등 다각적인 기능 분석을 통해 이 채널들이 생체 내에서도 1:3의 화학양론 구성비를 유지함을 확인하였다. 비대칭적 구조를 기반으로 TRPC1/C4 이종복합체의 이온 투과도 특성이 TRPC4 동종복합체와 확연히 다름을 확인하고, 그 조절 기전에 TRPC1 단백질의 특정 아미노산 잔기들이 핵심적으로 작용함을 규명하였다. 구체적으로, TRPC1의 선택성 필터(L601)와 S6 나선(H646) 잔기가 일가 양이온 투과도를, 중앙 공동의 잔기(K639)는 낮은 칼슘 투과도를 결정하였다.

약물 작용 기전 분석에서는 길항제 Pico145와 작용제 (−)-Englerin A (EA)의 아형 특이적 결합 특성과 활성화 기전을 밝혔다. 두 약물은 모두 디아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)의 결합 부위에 결합한 모습을 cryo-EM 구조를 통해서 알 수 있었는데, Pico145는 TRPC1의 소수성 잔기(LFFV)에 의해 TRPC1/C4 이종사합체에 더 높은 결합력을 보이는 반면, EA는 TRPC5 동종사합체에 더 강하게 결합함을 돌연변이체를 이용한 농도-반응 관계 분석으로써 확인하였다. TRPC3/6/7 채널의 L2 부위에 존재하는 특정 아미노산(페닐알라닌, 라이신)이 EA 결합을 저해함을 규명하여 EA의 TRPC 아형 선택성을 제시하였다.

한편, 본 연구는 TRPC5 동종복합체에 대한 EA의 직접 활성화 기전이 G 단백질 매개 활성화 기전과 현저히 다름을 밝혀내었다. EA는 G 단백질 매개 활성에 필수적인 칼슘 결합에 대한 의존도가 현저히 낮은 방식으로 채널을 활성화하였다. 또한, G 단백질 매개 활성에서 길항적 조절자 역할을 하며 PIP2 관련 지질 신호를 감지하는 것으로 예상되는 S2-S3 linker 내 보존된 두 트립토판 잔기(WW 영역)에
의한 조절 제약이 간접적으로 확인되었음에도 불구하고, EA 유도 활성화는 이를 극복하였다. 이러한 결과는 약물에 의한 채널 조절의 새로운 기전을 제시하며, 지질 신호전달과 채널 기능의 복잡한 상호작용 가능성을 시사한다.

본 연구는 TRPC 이종사합체의 비대칭적 구조, 동종사합체와 구분되는 이온 투과도 조절 원리, 그리고 아형 특이적 약물 결합 및 동종사합체에서의 약물 작용 기전에 대한 포괄적인 분자적 통찰을 제공한다. 이러한 발견은 TRPC 채널의 생리학적·병태생리학적 기능에 대한 이해를 증진시키고, 선택적인 TRPC 채널 조절제를 개발하기 위한 구조 기반 약물 설계에 중요한 토대를 제공한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

TRPC channels’ heterotetramerization confers functional diversity and therapeutic potential, yet a comprehensive understanding of their structural basis and drug interaction mechanisms has remained elusive. This study utilized cryo-EM to elucidate the first three-dimensional structures of TRPC1/C4 and TRPC1/C5 heterotetramers, revealing a functionally validated asymmetric 1:3 stoichiometry. These asymmetric structures were found to govern distinct ion permeability properties compared to TRPC4 homotetramers, with specific TRPC1 residues identified as key regulators of both monovalent cation and calcium permeability. Drug binding analyses clarified subtype-specific interactions: Pico145 exhibited higher affinity for TRPC1/C4 (attributable to hydrophobic TRPC1 residues), while EA demonstrated stronger binding to TRPC5 homotetramers, with its selectivity attributed to specific L2 loop residues. Additionally, EA’s direct activation of TRPC5 significantly differed from G-protein-mediated activation, displaying a reduced calcium dependence and overcoming regulatory constraints mediated by the WW region. Collectively, this research provides comprehensive molecular insights into TRPC heterotetramer structure, ion permeation, and drug regulation, offering a crucial foundation for structure-based design of selective TRPC channel modulators.

목차 (Table of Contents)

• 국문초록 (i)
• 제1장 서론 (6)
• 제2장 연구목표 (13)
• 제3장 연구방법 (14)
• 3.1 플라스미드 클로닝 및 돌연변이 제작 (14)
• 3.2 전기생리 (16)
• 3.3 실험 용액 및 시약 (17)
• 3.4 TRPC 채널의 활성화 조건 (19)
• 3.5 이온 투과도의 계산 (21)
• 3.6 형광 이미징 (23)
• 3.7 유효 FRET 효율의 계산 (25)
• 3.8 실험 결과의 통계적 처리 (27)
• 제4장 실험결과 (28)
• [제1부] 비대칭적 TRPC 이종사합체의 생물리학적 구조-기능 분석 (28)
• 4.1 비대칭적 화학양론 구성비의 TRPC 이종사합체 (29)
• 4.1.1 생체 내 TRPC 이종사합체의 화학양론 구성비 조사 (32)
• 4.2 아형 특이정 이온 투과도 결정 부위 (38)
• 4.2.1 일가 양이온의 투과도 결정 부위 조사 (38)
• 4.2.2 칼슘의 투과도 결정 부위 조사 (47)
• 4.3 아형별 약물 결합력 결정 부위 (54)
• 4.3.1 길항제 Pico145의 결합력 결정 부위 조사 (54)
• 4.3.2 작용제 (−)-Englerin A의 결합력 결정 부위 조사 (59)
• 4.3.3 (−)-Englerin A의 TRPC 아과 내 채널 선택성 기전 규명 (67)
• [제2부] TRPC5 동종사합체의 약리학적 조절기전 연구 (71)
• 4.4 TRPC 채널의 약물 직접 활성화 기전 (72)
• 4.4.1 작용제의 상승효과 (72)
• 4.4.2 (−)-Englerin A의 칼슘 비의존적 작용 (75)
• 4.5 S2-S3 linker에서 보존된 트립토판 잔기의 역할 (80)
• 4.5.1 WW 영역의 돌연변이가 G 단백질 매개 활성화에 미치는 영향 (80)
• 4.5.2 WW 영역과 (−)-Englerin A 활성화의 관계성 (87)
• 4.5.3 W434A 돌연변이를 통한 TRPC5의 탈감작 조절과 지질 신호 전달의 연관성 (91)
• 제5장 고찰 (96)
• 5.1 이온 투과도 결정 부위 (96)
• 5.2 화학양론 구성비 (99)
• 5.3 약물 결합 (101)
• 5.4 작용제와 지질의 조절 기전 및 관계성 (104)
• 5.4.1 WW 영역: PIP2 의존적 채널 조절의 분자적 기반 (105)
• 5.4.2 (−)-Englerin A와 Riluzole 동시 처치에 따른 탈감작 현상의 분석 (106)
• 5.5 병태생리학적 의미 (107)
• 5.6 한계와 향후 연구 방향 (109)
• 제6장 결론 (111)
• 참고문헌 (113)
• ABSTRACT (127)