Lysosome 파괴에 의한 세포사멸에서 PIG3의 기능에 대한 연구 = Biological role of PIG3 in lysosome-mediated apoptosis

국문 초록 (Abstract)

PIG3 (p53-inducible gene3)는 ROS에 의해 유도되는, p53 경로를 통한 세포사멸에 관여한다고 알려져 있다. 본 논문에서는 Yeast two-hybrid 기법을 통해 PIG3와 결합하는 단백질 중에서 lysosomal cysteine protease 의 일종인 Cathepsin B (CTSB)의 부분적인 염기서열을 human liver cDNA library로부터 확인 할 수 있었다. 또한 human prostate cancer cell line, PC3에서 PIG3와 CTSB의 상호작용을 PIG3와 CTSB 각각의 항체를 사용하여 Co-immunoprecipitation 기법으로 확인 하였다. CTSB는 lysosome 파괴를 통한 세포사멸에서 파괴된 lysosome으로부터 방출되어 mitochondria 파괴를 유도 하므로 PIG3와 CTSB의 상호 작용이 그 세포사멸에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. TNF-α(10㎍/ml)와 ActinomycinD(0.2㎍/ml) 를 처리하여 lysosome 파괴를 통한 세포사멸을 유도 한 후, PIG3유전자 발현을 감소 시키는 PIG3-siRNA를 transient transfection 한 PC3 세포와 음성대조군 세포에 TNF-α 와 actinomycinD 를 처리하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 기법으로 세포 생존율을 분석한 결과, siRNA 음성 대조군에 비해 생존율이 20% 정도 감소된 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 활성화된 caspase-8이 lysosome의 파괴를 유도하는 것으로 보고되어 있으므로, PIG3와 CTSB의 상호 작용과 caspase-8 활성화의 연관관계를 알아보고자 하였다. PIG3-siRNA transient transfection 한 PC3 세포에 TNF-α 와 actinomycinD 를 처리하여 lysosome 파괴를 통한 세포사멸을 유도하였을 경우 caspase-8 의 활성화가 siRNA 음성 대조군에 비해 4시간 정도 빠르게 진행되는 것을 관찰 하였다. 이들 결과를 종합해 볼 때 PIG3와 CTSB의 상호작용이 caspase-8의 활성화를 지연시킴으로써 lysosome 파괴를 통한 세포사멸을 초기단계부터 조절하는 것으로 판단된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The p53-inducible gene 3 (PIG3) is known to be a transcriptional target of p53 tumor suppress or protein, which involved in p53-mediated apoptosis induced by reactive oxygen repair (ROS). To determine the exact role of PIG3 during apoptosis, we partially cloned the Cathepsin B (CTSB), a lysosomal cysteine protease, from human cDNA library using the Yeast two hybrid technique. The PIG3 was interacted with the CTSB in human prostate cancer cell line PC3, which was verified by co-immunoprecipitation analysis using specific anti-PIG3 polyclonal antibodies and anti-CTSB monoclonal antibodies. Since the released CTSB from the destabilized lysosomes induced the mitochondrial disruption during lysosome-mediated apoptotic responses, we investigated the role of interaction between PIG3 and CTSB in the apoptosis. When we examined the cell viability of PC3 cells by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay after induction of lysosome-mediated apoptosis by TNF-α(10㎍/ml)와 ActinomycinD(0.2㎍/ml), the apoptotic responses were observed 8 hours after the treatment. The PIG3 silencing PC3 cells by transient siRNA transfection show the 20% less cell viability compared to that of the control-siRNA transfected cells 24hours after the treatment with TNF-α and actinomycinD. In the previous report, caspase-8 activation was closely related with lysosome destabilization during the apoptosis. Thus, we next investigated the relationships between the interaction of PIG3-CTSB and caspase-8 cleavage. The cleaved caspase-8 was detected 4 hours ealier in the PIG3-knock down PC3 cells in comparision with that in the control cells during lysosome-mediated apoptosis. Taken together, the PIG3 interaction with CTSB may play an important role in regulating the early step of lysosome-mediated apoptosis through the delayed caspase-8 activation.

목차 (Table of Contents)

• 국문 초록 = 1
• ABSTRACT = 3
• I.서론 = 5
• II.실험재료 및 방법 = 9
• 세포배양조건 = 9
• 시약 = 9
• PIG3와 CTSB 유전자의 클로닝 = 9
• PIG3와 CTSB 유전자의 형질도입 = 10
• Yeast two hybrid = 11
• RNA추출, cDNA합성과 PCR = 12
• 단백질 준비 및 Western blot = 13
• Co immunoprecipitation = 15
• siRNA의 설계 및 합성 = 16
• siRNA의 transfection = 18
• 세포 독성 측정 = 18
• 세포의 생존능력 측정 (Cell Viability Assay) = 19
• III . 결론 = 20
• Yeast two hybrid screening = 20
• PIG3 와 CTSB 의 발현 확인 = 20
• PIG3 와 CTSB 의 결합 = 21
• Lysosome이 관여 하는 세포사멸에서 PIG3의 역할 = 23
• IV.고찰 = 39
• V.참고문헌 = 43