효모 Saccharomyces cerevisiae 에서 재조합 인체 섬유아세포 성장인자(hFGF1)의 분비 발현 연구 = A study for the recombinant expression of human fibroblast growth factor in yeast Saccharomyces cerevisiae

국문 초록 (Abstract)

Acidic Fibroblast Growth Factor는 22개의 FGF Family 중에서 최초로 발견된 인체 FGF로서 분자량 15.8KDa의 단백질로 hFGF1 이라고 명명되었다. 이들 FGF Family 단백질들은 Heparin에 특이적으로 결합하는 성질을 가지고 있으며 특히 hFGF1은 다양한 세포의 분열을 촉진한다. FGF는 세포막에 존재하는 FGF 수용체 (Fibroblast growth factor receptor)와 결합하여 세포의 증식 및 분화를 조절하는 광범위한 생물학적 기능을 가진다. 따라서 hFGF는 상처 치료 및 피부 재생을 위한 목적으로 화장품 및 의약품으로 광범위하게 사용되고 있다.
효모 Saccharomyces cerevisiae 는 GRAS(Generally Recognized as Safe) 균주로서 식품 및 의약품 생산 공정에서 산업적으로 많이 사용되고 있다. S. cerevisiae 는 단백질 고발현을 위한 다양한 promoter와 외래유전자를 multicopy로 도입할 수 있는 plasmid가 있어 재조합단백질을 고수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.
본 연구에서는 효모에서 인체 유래 acidic Fibroblast Growth Factor (hFGF1)를 고분비 발현할 수 있는 분비 융합파트너 (Translational fusion partner, TFP) 시스템을 이용하여 고분비 생산 균주를 선별하고, 선별된 균주를 이용하여 hFGF1 의 발효 생산의 최적화 조건을 확립하였다. 확립된 최적 발효 조건 하에서 발효조를 이용한 재조합 S. cerevisiae 를 유가식 발효하여 배양한 결과 균주의 증식과 함께 재조합 hFGF1을 약 200 mg/L 수준으로 고분비, 생산됨을 확인하였다. 분비 생산된 hFGF1을 Heparin Sepharose를 이용하여 정제한 후 활성형의 재조합 hFGF1를 순수하게 얻을 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Acidic Fibroblast Growth Factor (aFGF) is a protein with a molecular weight of 15.8 KDa, which was first discovered among about FGF family, also called FGF1.
AFGF is a powerful and broad-spectrum to divide mitogen. FGF (fibroblast growth factor) and its receptor regulate a wide range of biological functions such as cell proliferation, survival and differentiation. Using these features, FGF is used in cosmetics and medicines for purposes such as wound regeneration and skin regeneration.
The yeast Saccharomyces cerevisiae is widely used industrially as a GRAS (Generally Recognized as Safe) strain in the production process of foods and medicines. Saccharomyces cerevisiae has the advantage of utilizing a strong, sophisticated and relatable promoter and the ability to produce recombinant protein with high yield by a multiple introduction method of plasmid DNA.
In this study, strains were produced and screened using a fusion partner (TFP) system that secretes and expresses recombinant acidic Fibroblast Growth Factor (aFGF) derived from the human body in yeast. And the selected strain was used to establish optimized conditions for the fermentation production of aFGF.
As a result of fed-batch fermentation and cultivation of genetically modified S. cerevisiae using fermenter under established optimum fermentation conditions, it was confirmed that the growth of the strain and recombinant aFGF were efficiently secreted and produced did.
Expressed protein produced was able to obtain pure recombinant aFGF using tablets using Heparin sepharose.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• List of Figures 8
• 국문 요약 10
• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 5
• 1. 사용균주 및 배양방법 5
• 2. hFGF1 유전자 합성 및 발현 균주 제작 7
• 3. 단백질의 분비 발현 확인 10
• 4. 재조합 균주의 선별 11
• 5. hFGF1생산을 위한 유가식 발효 14
• 6. 생산된 hFGF1의 정제 16
• Ⅲ. 결과 17
• 1. 재조합 단백질 최대 분비 발현 S. cerevisiae 균주의 선별 17
• 1-1. hFGF1 분비 발현 형질전환체 선별 17
• 1-2. HL16-hFGF1 분비 발현 형질전환체 선별 21
• 2. 유가식 발효를 통한 hFGF 생산 24
• 2-1. 발효조를 이용한 재조합 hFGF1 생산 24
• 2-2. 발효조를 이용한 재조합 HL16-HFGF1 생산 26
• 3. 발효 생산된 재조합 hFGF1의 정제 28
• 3-1. 재조합 hFGF1 정제 28
• 3-2. 재조합 HL16-hFGF1 정제 30
• 3-2-1. 재조합 HL16-hFGF1 정제 30
• 3-2-2. Enterokinase 처리 및 순수 hFGF1 정제 32
• Ⅳ. 결론 34
• Ⅴ. 참고문헌 36
• Abstract 39