TmTube plays an important role in antimicrobial peptides production in response to microbial infection in Tenebrio molitor = 갈색거저리의 미생물 감염 반응 시 항균펩타이드 생산에 있어 TmTube의 중요한 역할

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The Toll pathway, along with the Imd pathway, plays a critical role in regulating the production of antimicrobial peptides (AMPs) against microbial infections in insects. Tube, a homolog of vertebrate interleukin-1 receptor associated kinase-4 (IRAK-4), acts as a scaffold between death domains of Myeloid differentiation primary response 88 (MyD88) and Pelle, thereby mediating signal transduction that activates nuclear factor-kappa B (NF-κB) in Drosophila melanogaster. However, the antimicrobial function of Tube has not yet been studied in Tenebrio molitor. In this study, we identified the T. molitor Tube homolog sequence (TmTube) from an RNA sequencing dataset and investigated its immunological function using RNA interference (RNAi)-based molecular analyses. TmTube was highly expressed in the egg, late larval, and 2-day adult stages. The tissue-specific expression patterns revealed that TmTube was highly expressed in the gut of young larvae and adult females, and in the fat body of adult males and late larvae. In addition, TmTube expression was generally induced in the whole body and Malpighian tubules upon microbial infection and was upregulated at the early stages of E. coli and S. aureus infection in the gut and hemolymph. Accordingly, larval survivability and AMP expression were downregulated following TmTube knockdown against E. coli and S. aureus infection. In particular, TmTube knockdown significantly affected the expression of both Toll- and Imd-dependent AMP genes in the Malpighian tubules. Collectively, these findings demonstrate that TmTube functions beyond the Toll pathway and contributes to antibacterial defense through potential cross-talk with the Imd pathway in the Malpighian tubules.

국문 초록 (Abstract)

Toll 신호전달경로는 Imd 경로와 함께 곤충의 미생물 감염에 대응하여 항균펩타이드(AMP)의 생산을 조절하는데 주요한 역할을 한다. 척추동물의 interleukin-1 receptor associated kinase-4 (IRAK-4) 상동체인 Tube는 death domain을 통해 Myeloid differentiation primary response 88 (MyD88) 및 Pelle와 복합체를 형성한다. 이러한 기작을 통해 초파리 모델에서는 nuclear factor-kappa B (NF-ĸB)를 활성화시켜 AMP 생산 신호전달을 매개하는 것으로 알려져있다. 그러나 갈색거저리에서 Tube의 면역학적 기능에 대한 연구는 아직 수행되지 않았다. 본 연구에서는 RNA-seq dataset으로부터 확보된 TmTube 서열과 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 분자생물학적 기법을 통해 그 면역학적 기능을 조사하였다. TmTube는 알, 후기 유충, 성충 2일차 단계에서 높은 발현량을 보였으며, 조직별 발현양상 분석 결과, 초기 유충과 성충 암컷의 장에서, 그리고 성충 수컷과 후기 유충의 지방체에서 높은 발현량이 확인되었다. 또한 미생물 감염시 TmTube 발현량이 전신 및 말피기 소관에서 전반적으로 유도되었으며, 장과 혈림프의 경우 Escherichia coli와 Staphylococcus aureus 감염 초기에 대해 발현이 유도되었다. 이어서 RNAi를 통해 TmTube 발현을 일시적으로 억제시키고 미생물 감염에 대한 유충의 사충률 및 AMP 유도양상을 조사했다. 이에 대한 결과로, TmTube 발현 억제 시 E. coli와 S. aureus 감염에 대한 유충 생존율과 AMP 발현량은 감소하였다. 특히 TmTube의 발현 억제는 말피기 소관에서 Toll 및 Imd 신호전달경로 의존적 AMP 유전자들의 발현에 유의미한 영향을 미쳤다. 본 연구의 결과는 TmTube가 말피기 소관을 중심으로 Toll 경로에 국한되지 않고 Imd 경로와의 cross-talk을 통해 병원체 감염에 대항할 수 있는 가능성을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• List of Figure ⅳ
• Abstract ⅴ
• Ⅰ Introduction 1
• Ⅱ Materials and Methods 6
• 2.1 Insect rearing 6
• 2.2 Preparation of microoarganisms and infection 6
• 2.3 In silico analysis of TmTube 7
• 2.4 Cloning of TmTube 7
• 2.5 Sample preparation 9
• 2.5.1 Sample of developmental stage T, molitor 9
• 2.5.2 Sample of tissue-specific T. molitor 9
• 2.5.3 Sample of T. molitor against microbial infection 10
• 2.6 Total RNA extraction and cDNA synthesis 10
• 2.7 Identification of TmTube expression patterns 11
• 2.8 TmTube gene silencing 12
• 2.8.1 Synthesis of TmTube specific dsRNA 12
• 2.8.2 Assessment of TmTube RNAi efficiency by RT-qPCR 13
• 2.9 Analysis of the immunological function of TmTube by RNAi 14
• 2.9.1 Efficiency of TmTube knockdown 14
• 2.9.2 Effects of TmTube RNAi on larvae mortality against microbial infection 14
• 2.9.3 Effects of TmTube RNAi on AMP genes expression patterns 15
• 2.10 Statistical analysis 15
• Ⅲ Results 18
• 3.1 Sequence identification and domain analysis of TmTube 18
• 3.1.1 Sequence identification and genomic structure of TmTube 18
• 3.1.2 Domain analysis of TmTube 18
• 3.2 In silico analysis of TmTube 21
• 3.3 Temporal and spatial expression patterns of TmTube 24
• 3.4 Effects of microbial infection on TmTube expression patterns 26
• 3.5 Investigation of the immunological function of TmTube based on RNAi 28
• 3.5.1 Larval mortality following TmTube gene silencing against microbial infection 28
• 3.5.2 Effects of TmTube gene silencing on AMP gene expression 30
• Ⅳ Discussion 38
• References 45
• 국문초록 54