Regulation of TDAG51 in TLR4-mediated inflammatory pathway

국문 초록 (Abstract)

염증반응(Inflammatory response)이란 생체조직의 손상에 따른 항원의 침입에 대한 국소적인 방어 보호 반응이다. 그 과정을 간략히 설명한다면 조직의 손상에 따라 박테리아와 같은 항원이 침입하게 되면 박테리아로부터 화학물질이 방출된다. 그에 따라 혈관내의 대식세포와 같은 식균성 세포(Phagocyte)가 박테리아를 쫓아 혈관 밖으로 빠져 나오게 된다. 그 후 식균 작용(Phagocytosis)에 의해 박테리아가 제거되고 조직이 치유되게 된다. 이처럼 염증반응은 생체 내 방어를 위한 반응이지만 다양한 만성 질병의 발병 및 진행과 연관이 되어있다는 것이 알려졌다.
선행 연구의 결과로 인해 염증반응에 장기간 노출될 때, 주변 환경 및 생체 내 변화와 같이 영향을 끼쳐서 다양한 난치병의 발병, 진행과 연관이 있다는 것이 밝혀졌기 때문에 염증반응의 발현을 자유롭게 조절할 수 있게 되면 다양한 난치병의 치료에도 도움을 줄 수 있을 거라고 추정할 수 있다.
우선 염증반응은 톨유사수용체(Toll-like receptor, TLR)가 활성화되면서 시작된다고 알려져 있다. 톨유사수용체의 톨(Toll)이란 본래 초파리의 내재성 면역 반응을 담당하는 유전자로 알려져 있으며 쥐나 사람의 유전자에서 비슷한 역할을 하는 유전자를 연구한 결과 톨유사수용체에 대해 알려지게 되었다. 톨유사수용체는 13종류가 존재하며 톨유사수용체 마다 다양한 리간드(Ligand)를 받아들여 면역반응을 일으킨다고 알려졌다. 각 톨유사수용체에 의한 신호경로는 차이를 보이지만 결과적으로 염증성 사이토카인을 활성화시켜 염증반응를 유도한다고 알려졌다.
다양한 톨유사수용체에 의한 염증반응 중에서 톨유사수용체4(TLR4)에 의한 염증반응이 광범위하게 연구되었다. TLR4 염증반응은 그람 음성 박테리아의 외막 표면에 존재하는 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)에 의해 발생하며 리포폴리사카라이드가 톨유사수용체4 표면에 결합을 하면 하위 신호경로를 통해 염증성 사이토카인이 발현되며 그로 인해 염증반응이 발생한다.
한편 TDAG51(T cell death associated 51)은 T 세포 혼성세포주에서 처음 그 존재가 알려져 있으며 T 세포 내에서 세포 자연사가 활성화되는 과정에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이 TDAG51은 다양한 세포에게 스트레스를 주는 환경과 연관이 되있다고 알려져 있으며 Leishmania donovani라는 원생동물을 감염시킨 후 대식세포의 유전자 발현을 확인한 결과 TDAG51이 13배 가까이 증가한 것을 확인했다.
하지만 TDAG51과 톨유사수용체4와의 연관성은 거의 밝혀진 바가 없어서 TDAG51이 톨유사수용체4에 의한 염증반응에 어떤 방식으로 관여하는지에 대한 연구를 수행하게 되었다. 그 결과 톨유사수용체4 신호경로에 의해 TDAG51이 유도된다는 사실과 TDAG51이 발현되는 경로가 TNF receptor associated factor-6(TRAF6)의 하위신호경로를 경유한다는 사실을 알아냈으며, 이렇게 발현된 TDAG51이 톨유사수용체4신호경로 내에서 염증성 사이토카인을 증가시켜 염증반응을 심화시킨다는 사실을 알아냈다. 비록 TDAG51의 프로모터에서 리포폴리사카라이드에 반응하는 위치를 찾는 데에는 실패했지만 TDAG51이 톨유사수용체4에 의한 신호경로 내에서 염증반응을 심화시키는 역할을 수행한다는 것을 발견한 것은 염증반응을 효과적으로 조절할 수 있는 가능성을 보여준 것이라 할 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 13
• 2.1 Chemicals and Antibodies 13
• 2.2 Cell culture 14
• 2.3 Preparation of bone marrow-derived macrophages (BMMs) 15
• 2.4 Preparation of peritoneal macrophages 15
• 2.5 TDAG51 induction by chemicals 16
• 2.6 Kinase inhibitors test 16
• 2.7 Western blot analysis 17
• 2.8 Promoter assay 18
• 2.9 Semi-quantitative RT PCR 19
• 2.10 Real-time PCR 20
• 2.11 LPS-challenged lethality test 20
• 3. Results 22
• 3.1 TDAG51 is induced by TLR4 signaling pathway 22
• 3.2 TDAG51 is induced by diverse TLR ligands 24
• 3.3 TDAG51 induction is triggered in RAW264.7 and peritoneal macrophage 26
• 3.4 LPS-induced TDAG51 gene expression is not triggered in TRAF6 KO BMM 28
• 3.5 TDAG51 is mediated by downstream signaling of TRAF6 30
• 3.6 LPS-mediated Induction of TDAG51 promoter activity is up-regulated irrespectively TDAG51 promoter length 32
• 3.7 LPS-induced Inflammatory cytokine expression is reduced in TDAG51 KO BMMs 35
• 3.8 LPS-challenged lethality is reduced in TDAG51 KO mouse 37
• 4. Discussion 39
• 5. References 42
• 6. Abstract 44