Identification of the transporter responsible for the efflux of 20-HETE-glucuronide in the human hepatocyte cell line HepG2 and Huh-7 cells = 인간 HepG2 및 Huh-7 세포에서 20-HETE-glucuronide의 세포 밖 수송을 담당하는 수송단백체 규명

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objectives: Although 20-Hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE), a metabolite derived from arachidonic acid, has been known to be involved in the pathophysiological mechanisms of cardiovascular diseases and cancer development, the mechanism responsible for its cellular elimination remains poorly understood. Therefore, the present study was conducted to identify the transporter responsible for the efflux of 20-HETE-glucuronide. A further research goal was to study the cytotoxicity and changes in gene expression profiles induced by intracellular 20-HETE accumulation.

Methods: The cellular expression of efflux transporters was confirmed by RT-PCR, qRT-PCR, and immunoblot assay. Changes in the amount of 20-HETE-glucuronide transported out of the cells were determined by enzyme-linked immunosorbent assay with and without chemical inhibitors and siRNAs specific for each transporter. Cytotoxicity induced by the accumulation of 20-HETE within the cells was confirmed by CCK-8 assay, and the impact of 20-HETE on changes in gene expression was investigated by RNA sequencing analysis.

Results: Treatment with MK571 and Ko143, chemical inhibitors specific for multidrug resistance-associated protein (MRP) and breast cancer resistance protein (BCRP), decreased the amount of 20-HETE-glucuronide transported out of the cells by 69-99% (p < 0.001) and 58-63% (p < 0.01), respectively. With the exception of these two transporters, there were no significant differences in 20-HETE-glucuronide efflux in the other transporters with the inhibitors. Treatment with siRNAs specific for MRP2 and BCRP decreased the amount of 20-HETE-glucuronide transported out of the cells by 47% (p < 0.05) and 32% (p < 0.05), respectively, as the expression of each transporter protein decreased. The use of chemical inhibitors and siRNAs against the corresponding transporter proteins in Huh-7 cells yielded the same pattern of results as in HepG2 cells. Intracellular accumulation of 20-HETE resulted in a significant decrease in cell viability by up to 48% (p < 0.01), and concomitantly, there was an increase in transcriptomic expression associated with cardiovascular disease and cell division.

Conclusions: MRP2 and BCRP were identified as the main transporters involved in the efflux of 20-HETE-glucuronide. Moreover, it was found that intracellular accumulation of 20-HETE caused cytotoxicity and up-regulated the expression of transcripts associated with cardiovascular disease and cell division. The present studies provide a molecular mechanism for the transporter of intracellular 20-HETE out of the cells and a method for controlling the amount of intracellular 20-HETE. The present results would lay the foundation for further studies on the mechanisms of 20-HETE-induced cardiovascular diseases, cancers, and other cellular toxicities.

국문 초록 (Abstract)

목적: Arachidonic acid로부터 대사되는 20-Hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE)가 심혈관계 질환 및 암 발생에 관여한다는 사실이 널리 알려져 있음에도 불구하고 20-HETE의 세포 밖 수송 메커니즘에 대한 연구는 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는 20-HETE-glucuronide가 세포 밖으로 수송될 때 관여하는 수송단백체를 규명하는 것을 목표로 하였다. 또한 세포 내 20-HETE가 축적됨에 따라 야기되는 세포 독성과 유전자 발현의 변화를 알아보고자 하였다.

방법: HepG2와 Huh-7 세포에서 수송체의 발현양을 RT-PCR과 qRT-PCR, immunoblot assay를 통해 확인하였다. 각 수송체 특이 저해제와 siRNA를 세포 배양 중 처리하여, 처리군과 비처리군 사이에 세포 밖으로 수송되는 20-HETE-glucuronide 양의 변화를 enzyme-linked immunosorbent assay를 통해 분석하여 어떤 수송체가 관여하는지 확인하였다. 세포 내 20-HETE 축적에 따른 세포 독성은 CCK-8 assay를 통해 확인하였으며, RNA-sequencing을 통하여 20-HETE에 의한 전사체 발현 변화를 분석하였다.
결과: Multidrug resistance-associated protein (MRP)와 breast cancer resistance protein (BCRP) 각각에 특이적인 화학적 저해제인 MK571와 Ko143을 처리하였을 때, 세포 밖으로 수송되는 20-HETE-glucuronide가 69-99% (p < 0.001)와 58-63% (p < 0.01)로 각각 감소하였다. 그 밖에 다른 수송체에서는 해당 저해체를 처리하였을 때 유의적인 차이가 없었다. MRP2와 BCRP 각각에 특이적인 siRNA를 처리하였을 때, 수송단백체의 발현양이 감소함에 따라 세포 밖으로 수송되는 20-HETE-glulcuronide의 양이 각각 47% (p < 0.05), 32% (p < 0.05) 감소하였다. HepG2 세포에서 화학적 저해제와 siRNA를 사용하여 도출된 결과는 같은 방법으로 다른 간 세포주인 Huh-7 세포에 처리하였을 때에도 유사한 결과가 관찰되었다. 세포 내 20-HETE가 축적됨에 따라 세포의 생존율이 최대 48% (p < 0.01)로 감소하였을 뿐만 아니라, 심혈관계 질환 및 암에 관련된 전사체의 발현이 유의적으로 증가되었다.

결론: MRP2와 BCRP가 20-HETE-glucuronide를 세포 밖으로 수송하는데 관여하는 주요 수송단백체임을 확인하였다. 또한 세포 내 20-HETE 축적은 세포 독성을 야기하고 심혈관계 질환 및 세포분열과 관련된 전사체의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 본 연구결과는 20-HETE를 세포 밖으로 수송하는 기전을 제시하였으며, 세포 내 20-HETE 농도를 제어하는 방법을 제공하여 향후 20-HETE의 세포 독성 메커니즘에 대한 추가적인 연구를 이어 나갈 수 있는 토대를 마련하였다고 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Objectives 7
• Ⅲ. Materials and Methods 8
• Ⅵ. Results 21
• Ⅴ. Discussion 52
• Ⅵ. Conclusion 62
• References 64