Characterization of bioactive substances from culture filtrate extraction of Leuconostoc mesenteroides LabMP-A04 = Leuconostoc mesenteorides LabMP-A04의 배양 추출물에서 유래한 생리활성 물질의 특성

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Lactic acid bacteria (LAB) have antimicrobial properties because they contain the existence of bioactive substances with low molecular weight. Previous studies have provided compelling evidence of the antimicrobial activity of cyclic dipeptides (CDPs) derived from culture filtrates (CFs) of Lactobacillus plantarum LBP-K10 and the highly effective antimicrobial probiotic Leuconostoc mesenteroides LBP-K06. These microorganisms were isolated from traditional Korean kimchi. The results of our research suggest that these Lb. plantarum LBP-K10 show significant efficacy against multidrug-resistant bacteria. However, there is limited literature on the various biological activities of Ln. mesenteroides and its low-molecular-weight compounds are present in secondary metabolites, exhibiting distinctive chemical structures. To address this issue, this study aims to investigate the impact of low-molecular-weight peptidyl derivatives ranging from 100 to 600, obtained from Ln. mesenteroides LabMP-A04, a newly isolated strain from Korean traditional fermented kimchi. The CFs obtained from the three-day cultured Ln. mesenteroides LabMP-A04 was extracted using methylene chloride and then fractionated through preparative-high performance liquid chromatography (prep-HPLC), resulting in 13 distinct fractions. The fractions were analyzed using gas chromatography Multi-Omics High Resolution Mass Spectrometry (GC-HRMS) with both electron ionization (EI) and chemical ionization (CI) techniques. The fragmentation patterns from EI and CI showed that the fractionated samples contained various CDPs. These included eight proline-based CDPs, cyclo(Thr-Pro), cyclo(Ala-Pro), cyclo(Pro-Pro), cyclo(Val-Pro), cyclo(Tyr-Pro), two cyclo(Leu-Pro), three cyclo(Phe-Pro), and cyclo(Trp-Pro). Additionally, one CDPs were not based on proline, cyclo(Leu-Leu) and a non-peptidyl compound, DL-3-phenyllactic acid, was identified in the fractionated fraction. A considerable proportion of the fractionated samples consisted of the most basic form of CDPs, 2,5-diketopiperazines. Based on this finding, it can be inferred that Ln. mesenteroides LabMP-A04 culture and/or its liquid-liquid solvent extracts can isolate bioactive CDPs. To investigate the proteins associated with the biosynthesis of CDPs, proteins were obtained from cultured Ln. mesenteroides LabMP-A04 cells and separated using weak-anion exchange chromatography. Furthermore, an analysis was conducted using ninhydrin staining with an amino acid substrate. The activity staining on native gels revealed colorless bands, indicating the presence of active proteins. The observed colored bands suggests that amino acids do not form chromophores. The colorless areas were excised and analyzed using 2D Liquid Chromatography Multi-Omics high-resolution mass spectrometry (LC-HRMS). Approximately 14 proteins were identified. The study shows that proteins are linked to CDPs biosynthesis. Two proteins are being considered for investigation: branched-chain amino acid aminotransferase (BCAAT, gi: KGB51011.1) with a molecular mass of 38 kDa, and universal stress protein (USP, gi: TLP97301.1) with a molecular mass of 15.7 kDa. The gene sequences for both proteins were obtained from the NCBI Genome Database. The first protein had a nucleotide sequence length of 1,044 bp, while the second protein had a nucleotide sequence length of 432 bp. The gene sequences of both proteins were amplified using polymerase chain reaction, inserted into the pGEM T-easy vector, and cloned into the pET-15b expression vectors using NdeI/XhoI and NdeI/BamHI, respectively. The insert was then transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS cells for efficient protein production. Protein overproduction was induced by adding isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). It was hypothesized that inducing protein overproduction with IPTG would enhance the synergistic effect by selectively synthesizing CDPs. This strategy, using recombinant proteins, has various applications in veterinary antibiotics, functional foods, and non-toxic natural food preservatives.

국문 초록 (Abstract)

유산균(LAB)은 저분자 생리활성 화합물을 함유하고 있어 항균성이 있다. 선행 연구에서는 Lactobacillus plantarum LBP-K10과 매우 효과적인 항균 프로바이오틱스인 Leuconostoc mesenteroides LBP-K06의 배양추출물에서 추출한 싸이클릭 디펩타이드의 항균 활성에 대한 강력한 증거가 제시된 바 있다. 이 미생물들은 한국 전통 김치에서 분리한 것이다. 연구 결과에 따르면 Lb. plantarum LBP-K10은 다제내성균에 대해 상당한 효능을 보이는 것으로 나타났다. 그러나 Ln. mesenteroides의 2차 대사산물에 존재하는 독특한 화학구조를 나타내는 저분자 화합물에 대한 문헌은 제한적이다. 그래서 본 연구에서는 한국 전통 발효 김치에서 새로 분리한 균주인 Ln. mesenteroides LabMP-A04에서 얻은 100~600 분자량의 저분자 펩티딜 유도체가 미치는 영향에 대해 조사하는 것을 목표로 한다. 3일간 배양한 Ln. mesenteroides LabMP-A04에서 얻은 배양 여과물을 메틸렌 클로라이드를 사용하여 추출한 후 배양 추출물을 분취용 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 분획한 결과 13개의 뚜렷한 분획물이 생성되었다. 분획물은 전자 이온화 및 화학 이온화 기법과 함께 기체 크로마토그래피 다중 오믹스 분해능 질량 분석기를 사용하여 분석하였다. 전자 이온화와 화학 이온화의 단편화 패턴은 분획 된 샘플에 다양한 사이클릭 디펩타이드가 포함되어 있음을 보여주었다. 여기에는 프롤린 기반의 싸이클릭 디펩타이드 11개, cyclo(Thr-Pro), cyclo(Ala-Pro), cyclo(Pro-Pro), cyclo(Val-Pro), cyclo(Tyr-Pro), cyclo(Leu-Pro) 2개, cyclo(Phe-Pro) 3개, cyclo(Trp-Pro)가 포함되었다. 또한 비프롤린 기반 사이클릭 디펩티드 1개, cyclo(Leu-Leu) 비펩티딜 화합물 DL-3-phenylactic acid도 확인되었다. 분획 된 샘플의 상당 부분은 가장 기본적인 형태의 사이클릭 디펩타이드인 2,5-디케토피페라진으로 구성되어 있었다. 이 결과를 바탕으로, Ln. mesenteroides LabMP-A04 배양 및/또는 그 액체-액체 용매 추출물이 생리활성 싸이클릭 디펩타이드를 분리할 수 있다고 추론할 수 있다. 사이클릭 디펩타이드의 생합성과 관련된 단백질을 조사하기 위해 배양된 Ln. mesenteroides LabMP-A04 세포에서 단백질을 얻고 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다. 또한 아미노산 기질로 닌히드린 염색 반응을 이용하여 분석을 수행하였다. Native PAGE 겔의 활성 염색은 활성 단백질의 존재를 나타내는 무채색의 밴드를 나타냈다. 관찰된 무채색의 밴드는 아미노산이 발색단을 형성하지 않음을 시사한다. 무채색 밴드 부위을 절제하고 액체 크로마토그래피 다중 오믹스 분해능 질량 분석기을 사용하여 분석하였다. 이를 통해 약 14개의 단백질이 확인되었다. 이 연구는 단백질이 사이클릭 디펩타이드 생합성과 관련이 있음을 보여준다. 분자량이 38 kDa인 branched-chain amino acid aminotransferase (BCAAT, gi: KGB51011.1)와 분자량이 15.7 kDa인 universal stress protein (USP, gi: TLP97301.1) 두 가지 단백질이 사이클릭 디펩타이드 생합성과 관련될 것으로 예상하였다. 두 단백질의 유전자 서열은 NCBI 게놈 데이터베이스에서 얻었다. 첫 번째 단백질의 유전자 서열 길이는 1,044 bp이고, 두 번째 단백질의 유전자 서열 길이는 432 bp로 확인되었다. 두 단백질의 유전자 서열을 중합효소연쇄반응을 사용하여 증폭하고, pGEM T-easy 벡터에 삽입한 후 각각 NdeI/XhoI 및 NdeI/BamHI를 사용하여 pET-15b 발현 벡터에 클로닝하였다. 그런 다음 효율적인 단백질 생산을 위해 plasmid DNA를 E. coli BL21(DE3) pLysS 세포로 형질 전환하였다. isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하여 단백질 과잉 생산을 유도하였다. IPTG로 단백질 과생산을 유도하면 CDPs를 선택적으로 합성하여 시너지 효과를 높일 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. 재조합 단백질을 이용한 이 전략은 동물용 항생제, 기능성 식품, 무독성 천연 식품 보존제 등에 다양하게 응용될 수 있을 것이다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT = i
• TABLE OF CONTENTS = iv
• CHAPTER I INTRDUCTION = 1
• CHAPTER II MATERIALS AND METHODS = 5
• 2.1. The culture supernatant = 6
• 2.1.1. Isolation of LABs = 6
• 2.1.2. Identification of isolated LAB = 6
• 2.1.3. Culture conditions = 7
• 2.1.4. Liquid-liquid extraction = 8
• 2.1.5. Disk diffusion assay = 8
• 2.1.6. HPLC analysis = 9
• 2.1.7. HPLC fractionation = 9
• 2.1.8. Gas chromatography Multi-Omics High Resolution Mass spectrometry (GC-HRMS) = 9
• 2.2. The identification and overproduction of proteins related to CDP biosynthesis = 10
• 2.2.1. Crude protein extraction = 10
• 2.2.2. DEAE anion exchange chromatography = 10
• 2.2.3. Activity staining using ninhydrin for detection active protein = 10
• 2.2.4. Liquid chromatography Multi-Omics High resolution Mass Spectrometry(LC-HRMS) analysis = 11
• 2.2.5. Sequence alignment = 12
• 2.2.6. The overproduction of recombinant proteins = 12
• CHAPTER III RESULTS = 14
• 3.1. The potent bioactive Ln. mesenteroides LabMP-A04 CFs = 15
• 3.1.1. Optimal Ln. mesenteroides LabMP-A04 culture conditions for isolating bioactive compounds = 15
• 3.1.2. Nine types of CDPs obtained through the Ln. mesenteroides LabMP-A04 CF’s MCE = 21
• 3.2. Overproduction recombinant proteins involved in CDP biosynthesis = 36
• 3.2.1. Detection proteins involved in the biosynthesis of CDP = 36
• 3.2.2. Overproduction of recombinant CDP biosynthesis protein = 46
• CHAPTER IV DISCUSSION = 55
• REFERENCES = 58
• 국문 요지 = 61