미생물의 농화배양을 이용한 가축분뇨의 암모니아 가스 감소

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

A study was conducted to reduce the malodour of livestock manure by enrichment culture of microbial strains. The enrichment culture of various environmental sources such as nuruk (NR), vermicompost (VC), pig manure sludges in Haman (JM1, JM2) was performed in self-made reactors containing the livestock manure. Ammonia concentration, pH, TOC and total nitrogen content were measured to investigate the effect of enrichment cultures on the reduction of ammonia gas in the five reactors with different treatments. The concentration of ammonia gas in the reactors was measured for 12 days at 2 days-interval by using the gas detecting tube. In NR and JM2 reactors, a significant decrease in ammonia concentration was observed as compared to that in other reactors. A total of 32 major bacterial and yeast species were isolated from NR and JM2 reactors according to the different morphology and pigment production of isolates. Among these isolates, YC7058 and YC7068 showing high ammonia reduction activity were identified to be closely related to Debaryomyces hansenii ylx-13 (99%), Debaryomyces hansenii T136-NL1 (99%) and Bacillus siamensis KCTC 13613T (100%) on the basis of ITS (Nuclear ribosomal internal transcribed spacer) region, 26S rDNA gene and 16S rRNA gene sequence respectively. A yeast strain YC7058 was isolated from a JM2 reactor. Cells are spherical to short-ovoid, non-motile and proliferated by multilateral budding and produce spherical ascospore. The strain YC7058 grew with the temperature 10-37℃ and pH range 4.0-10.0. It survived and grew in the salinity level from 0 to 13% (w/v) and 50% glucose. Phylogenetic analysis of ITS region sequences and 26S rDNA gene sequences demonstrated that strain YC7058 was closely related to Debaryomyces hansenii ylx-13 (99%) and Debaryomyces hansenii T136-NL1 (99%). A bacterial strain YC7068 was isolated from a NR reactor. Cells are Gram-positive, rod-shaped and motile. Strain YC7068 grew with the temperature 10-60℃ and pH range 4.5-9.0. It survived and grew in the salinity level from 0 to 12% (w/v). Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences demonstrated that strain YC7068 was closely related to Bacillus siamensis KCTC 13613T (100%).
These isolates are now under field treats for industrial application to remove the odor of the livestock manure.

국문 초록 (Abstract)

축산분뇨 내에서 암모니아 감소능을 나타내는 미생물을 분리하기 위해 총 5개의 지렁이분변토, 누룩 등이 첨가된 반응기에서 농화배양을 이용하여 실험을 실시하였다. 반응기 내부의 환경 변화 정도를 조사하기 위하여 12일 동안 3일 간격으로 온도, pH, Total organic carbon(총 유기탄소) 및 Total nitrogen(총 질소) 함량 등 변화를 조사하였다. 암모니아를 측정한 결과 5개 반응기 중 2개의 반응기(NR, JM2)에서 총 12일 동안 암모니아가 낮게 유지되는 것을 확인할 수 있었으며, 2개의 반응기에서 암모니아 감소에 관여하는 미생물이 존재할 것으로 예상되었다. NR, JM2 반응기에서 총 32개의 미생물을 분리한 후 단일 순수 배양하여 배양액을 다시 축산분뇨와 동일한 양으로 혼합한 뒤 암모니아를 측정한 결과, 총 3개의 미생물이 양성 대조군인 Bacillus subtilis 보다 낮은 암모니아 수치를 보였으며, 반복적인 실험을 통해서 최종적으로 YC7058, YC7068을 선택하여 동정하고자 하였다.
YC7058 균주는 JM2 반응기에서 순수분리 하였고, 모세포가 2-3µm크기의 다극성 출아형의 영양생식을 하는 자낭효모 형태였으며, 운동성이 없었다. 생리․ 생화학적 특성은 pH 4.0-10.0 , 온도 10-37℃에서 생장하였고, NaCl 13%미만 범위에서 생장하였다. 또한, 50% Glucose에서 생장 가능하였다. 이 균주를 ITS gene sequencing과 26S rDNA gene sequencing을 통하여 계통 발생 분석결과 Saccharomycetaceae 과의 Debaryomyces 속에 속한 것으로 확인되었으며, ITS gene을 통해서 Debaryomyces hansenii ylx-13과 26S rDNA gene을 통해서 Debaryomyces hansenii T136-NL1과 가장 가까운 수치로 각각 99%의 유사도를 나타냈었다. YC7068 균주는 NR 반응기에서 순수분리 하였고, 0.6-0.63 × 2.0-4.2　µm크기의 Gram 양성의 간균 형태이며, 운동성이 있었다. 생리․ 생화학적 특성은 통성 혐기성 균으로 pH 4.5-9.0 , 온도 10-60℃에서 생장하였고, NaCl 12%미만 범위에서 생장하였다. 이 균주를 16S rRNA gene sequencing을 하여 계통 발생 분석결과 Bacillaceae 과의 Bacillus 속에 속한 것으로 확인되었으며, Bacillus siamensis KCTC 13613T 와 가장 가까운 수치로 100%의 유사도를 나타냈었다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론
• 1. 연구배경 및 목적 1
• 2. 악취 발생에 대한 이해 3
• 1) 악취의 정의 3
• 2) 악취의 발생원 3
• 3) 악취의 특성 및 인간과 가축에게 미치는 영향 3
• 4) 악취 측정방법 4
• 3. 국내에서 시행되고 있는 탈취 기술 종류 및 장단점 6
• 1) 물리학적 탈취 7
• 2) 화학적 탈취 7
• 3) 생물학적 탈취 7
• 4. 이론학적 배경 : 암모니아의 생물학적 제거기작 8
• 1) 질산화탈질화 8
• 2) ANAMMOX 10
• 3) 암모니아 동화 10
• 5. 암모니아 감소 효과 미생물의 동정 11
• 1) 형태학적 분류 11
• 2) 생리 생화학적 분류 11
• 3) 분자 생물학적 분류 12
• Ⅱ. 재료 및 방법
• 1. 암모니아 수치 감소 미생물의 분리 13
• 1) 시료 준비 13
• 2) 시료 채취 및 이화학적 측정방법 14
• (1) pH(수소이온농도) 14
• (2) TOC(총 유기탄소) 15
• (3) T-N(총 질소) 15
• 3) 반응기내의 암모니아 수치 감소 미생물 분리 15
• 4) 선발된 YC7058, YC7066, YC7068 배양액 및 혼합배양액에 의한 암모니아 감소능 실험 16
• 2. 암모니아 감소 효과 나타내는 YC7058, YC7068 균주의 동정 17
• 1) 선발된 균주의 형태학적 관찰 및 생리 생화학적 특성 조사 17
• (1) 형태학적 특성 조사 17
• (2) 생리 생화학적 특성 조사 17
• 2) 선발된 균주의 분자생물학적 특성 조사 18
• (1) 5.8S-ITS region, 26S rDNA, 16S rRNA 염기서열 분석 18
• (2) 계통학적 분석 19
• Ⅲ. 결과 및 고찰
• 1. 반응기 내부의 환경 및 암모니아 가스 변화 20
• 1) 반응기 내 pH 변화 20
• 2) 반응기 내 온도 변화 21
• 3) 반응기 내 TOC 변화 22
• 4) 반응기 내 암모니아 가스 및 total nitrogen 변화 23
• 5) 반응기 내 CFU (colony forming unit)변화 24
• 2. 반응기 내 분리된 미생물 균주의 암모니아 감소능 시험 25
• 3. 반응기 내 암모니아 감소능 미생물 균주(YC7058, YC7068)의 동정 30
• 1) YC7058, YC7068 균주의 형태학적 및 생리 생화학적 특성 30
• 2) YC7058, YC7068 균주의 분자 생물학적 및 계통학적 분석 33
• (1) 5.8S-ITS region, 26S rDNA, 16S rRNA 염기서열 분석 및 계통학적 분석 33
• Ⅳ. 요 약 35
• Ⅴ. 참 고 문 헌 36