Pseudomonas fluorescens BM07에서 생성된 pyoverdine-like pigment의 생합성 및 생화학적 특성에 관한 연구

이미숙 慶尙大學校 大學院 2004 국내석사

P. fluorescens BM07 cells grown on 70 mM succinic acid secreted a yellow-green pigment to culture medium. The pigment was purified using XAD-4 chromatography followed by CM Sephadex chromatography. The isolated pigment was characterized by amino acid analysis, UV/Vis spectroscopy, MALDI-TOF, Q-TOF and NMR spectroscopy. It was temporally identified as pyoverdine. The stoicheiometry of the Fe(Ⅲ)-pigment complex was 1:1. The spectral characteristics of Fe(Ⅲ)-chelated pyoverdine depended on pH. The pigment was considered to belong to an atypical pyoverdine that has two β-OH-Asp and chromophore as iron-binding ligands. The pigment can chelate Fe(Ⅱ) as well as Fe(Ⅲ). The amino acid composition of this siderophore was Serine, Glycine, Alanine and Lysine (1:2:2:3). Its molecular weight was about 1300. It was found that while pyoverdine was secreted to culture medium, little PHA was accumulated in the cell. When P. fluorescens was grown on fructose plus succinic acid, pyoverdine production was more favored than cell growth depending on succinic acid concentration. It is considered that there must be some genes linked between pyoverdine and PHA production pathway.

Colletotrichum orbiculare에 대한 길항세균 Pseudomonas aureofaciens YC4963의 분리 동정 및 항생물질의 정제와 구조 분석

채희정 慶尙大學校 大學院 2004 국내석사

A bacterial strain YC4963 with antifungal activity against Colletotrichum orbiculare, a causal organism of cucumber anthracnose was isolated from the rhizosphere soil of Siegesbeckia pubescens Makino in Korea. Based on physiological and biochemical characteristics and 16S ribosomal DNA sequence analysis, the bacterial strain was identified as Pseudomonas aureofaciens. The bacteria also inhibited mycelial growth of several plant fungal pathogens such as Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum and Rhizoctonia solani on PDA and 0.1 TSA media. The antibiotic activity was found from the culture filtrate of M523 media and the active compounds were quantitatively bound to XAD adsorber resin. The antibiotic compound inhibited the growth of C. orbiculare at 1% on PDA but it had no activity to Pythium ultimum and Rhizoctonia solani which was reported to be sensitive to phenazine antibiotics. The chemical data from various chromatographic procedures showed that the active fraction consisted of phenazine derivatives and the active compounds was identified as phenazine 1-carboxylic acid.

Development of Immunoglobulin Y (IgY) as a Detection Tool and its Antibacterial Effect on Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus : vulnificusVibio parahaemolyticus와 Vibio vulnificus 분석용 immunoglobulin Y (IgY) 개발과 항균효과 확인

니마카심 경상대학교 대학원 2012 국내박사

Production of specific immunoglobulins (Ig) and their applications in prophylactic, therapeutic, detection of microbial contaminants and as a diagnostic tool has been widely studied with limited information from other avians. Polyclonal egg yolk immunoglobulins Y (IgYs) are easier to harvest in large quantity and comply with the experimental animals care and use policy. As a detection tool, specific polyclonal antibodies (IgYs) from Coturnix quail (Coturnix coturnix japonica) egg yolk against Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus were produced and used to optimize indirect ELISA procedures. Formalin inactivated (FIVP, FIVV, mixed FI-VP/VV) and heat inactivated (HIVP, HIVV, mixed HI-VP/VV) Vibrio immunogens (109 CFU/mL) were intramuscularly immunized into quail through thigh muscles. Eggs were collected daily, labeled accordingly and IgY was purified from the egg yolk once a week. Three methods; water dilution / ammonium sulfate precipitation, &#1179;-Carrageenan precipitation, and dextran sulphate / polyethylene glycol methods were tested to select a suitable method for purification of IgY. The purity of IgY products from the three methods were analysed on SDS-PAGE and the activity was determined by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). The cross reactivity of both IgYs was analysed by ELISA and Western blot. Of the three methods, water dilution / ammonium sulfate precipitation provided high purity of IgY products with the light and heavy chains at 25 and 68 kDa respectively, &#1179;-Carrageenan precipitation, and dextran sulphate / polyethylene glycol methods resulted into poor purity of the IgY products. Formalin inactivated immunogens induced high humoral immune response for both V. parahaemolyticus and V. vulnificus over heat inactivated immunogens. However, IgYs resulted from HIVP and FIVV immunogens, showed high specificity to V. parahaemolyticus and V. vulnificus respectively. Detection limits of the indirect ELISA using the produced IgYs were 105 CFU/mL for V. parahaemolyticus and 106 CFU/mL for V. vulnificus. The developed antibodies showed high binding affinity to their corresponding antigens, very little cross reactivity to other Vibrio species on ELISA, and a cross reaction to Staphylococcus aureus on ELISA and Western blot. Both IgYs had negligible or no cross reaction to other bacteria strains (p<0.05) tested, a phenomenon which was observed in both ELISA and Western blot. Polyclonal antibodies labeled with a tracer have been commonly used as secondary antibodies in immunochemical assays to quantify the concentration of antibody-antigen complexes. Majority of these antibodies conjugated with a tracer are commercially available with the exception of few untouched targets. Since anti-chicken IgY-HRP was used as a secondary antibody in PART I to mark quail IgY in ELISA procedures due to the absence of commercial anti-quail IgY, an effort was taken to evaluate whether the use of anti-quail IgY could improve the sensitivity of the assay. Hence to do these, PART II of the study focused on the production and application of mouse anti-quail IgY as an intermediated antibody to link between quail IgY and goat anti-mouse IgG-HRP as primary and secondary antibodies respectively. Subsequently, the produced mouse anti-quail IgY was labeled with horseradish peroxidase (HRP), the formation of antibody-HRP complex was analysed on non-reducing SDS-PAGE and its efficiency on ELISA was compared with that of commercial rabbit anti-chicken IgY-HRP. Mouse anti-quail IgY was successfully produced and used as an intermediate antibody with good activity (1:10,000) and affinity to the primary and secondary antibodies. Subsequently, mouse anti-quail IgY was effectively conjugated with HRP enzyme resulting into a high molecular weight (about 200 kDa) band on SDS-PAGE supporting the formation of antibody-HRP complex. The obtained secondary antibody anti-quail IgY-HRP showed good activity (1:10,000) and affinity to quail IgY on indirect ELISA. Both mouse anti-quail IgY as an intermediate antibody and the conjugated mouse anti-quail IgY-HRP as a secondary antibody were effective in detecting quail IgY with similar detection limits (105 and 106 CFU/mL for V. parahaemolyticus and V. vulnificus respectively) as to the use of commercial rabbit anti-chicken IgY-HRP, signifying the efficiency of the produced and labeled antibody. Since quails produce very small amount of antibodies which may be attributed with their small size, small eggs and thus small yolk corresponding to the small amount of antigen required for immunization, antibodies produced in PART I could only be sufficient as a detection tool that use small amount of antibody. Hence, to study the antibacterial and prophylactic significance of IgYs, chicken were used with the same antigen. Water soluble fractions (WSF) of protein containing IgYs were isolated from the egg yolk of chickens initially immunized with formalin inactivated whole cells of either Vibrio parahaemolyticus or Vibrio vulnificus. The affinity of IgYs on their corresponding antigens, IgY titer throughout the immunization period, total and specific IgY contents of the WSF were determined by indirect ELISA. Total protein contents of the WSF were determined by protein assay method. Respectively, the inhibitory and protective effects of IgYs on the growth of V. parahaemolyticus and V. vulnificus was assayed in liquid medium and in mice pretreated with IgY followed by an oral inoculation of bacteria. IgYs resulted into high affinity to their corresponding antigens, high titer at day 28 from the first immunization onwards. Protein contents and total IgY concentrations remained stable throughout the immunization period, specific IgY concentrations increased steadily and reached a plateau at day 49 from the first immunization and was stable for further 3 weeks of observation. Comparing to the control IgY at the same concentration, specific IgY powder (150 mg/mL) significantly inhibited further multiplication of both V. parahaemolyticus and V. vulnificus in liquid medium based on optical density measurement and viable cell count. The bacteria count in mice feces was significantly lower in mice pretreated with specific IgYs than in those pretreated with PBS or control IgY. Higher survival of mice was observed in the experimental groups pretreated with either anti-V. parahaemolyticus (75% survival) or anti-V. vulnificus (87% survival) IgYs compared to those in the control groups pretreated with PBS or nonspecific IgY. All mice in the control groups died within three days after bacteria inoculation; hence the protective effect of specific IgYs against infection caused by V. parahaemolyticus and V. vulnificus was demonstrated. The in vitro and in vivo findings support the prophylactic and therapeutic applications of chicken IgY. 특이 면역단백질(immunoglobulin)의 생산과 예방, 처치, 미생물 오염의 검출 진단 키트 등에 대한 응용은 특정한 조류을 이용하여 광범위하게 연구되어 오고 있다. 다크론성 난황 면역글로블린 Y (IgY)는 많은 양의 항체를 확보하기에 쉽고, 실험에 사용되는 동물보호 및 동물보호 정책에 적합하다. 본 연구에서는 분석도구로서 메추라기에 Vibrio parahaemolyticus와 V. vulnificus에 대한 항원을 면역하여 메추리알에 IgY를 생산하고, 이들 세균을 분석할 수 있는 간접경쟁효소면역분석법(indirect ELISA)를 최적하였다. 먼저 두 비브리오 균들을 포르말린(FIVP, FIVV, mixed FI-VP/VV)과 열처리(HIVP, HIVV, mixed HI-VP/VV)하여 사균화시킨 뒤 109 CFU/ml 농도로 메추라기 다리 근육에 면역시켰다. 메추리알은 매일 회수하였으며, 라벨한 후 4℃에 보관하면서 1주일마다 정제하여 실험에 사용하였다. 난황은 water dilution-ammonium sulfate 침전법, κ-카르기난 침전법과 덱스트란 설페이트-폴리에틸렌 글라이콜을 이용하여 정제하였다. Water dilution-ammonium sulfate 침전법은 heavy chain과 light chain이 뚜렷하게 나타났고, 정제수율이 높은 것으로 확인되었으나, κ-카르기난 침전법과 덱스트란 설페이트-폴리에틸렌 글라이콜 정제법은 낮은 정제도를 나타냈다. 포르말린 처리한 면역원의 경우 두 세균 모두에 항체형성능이 높은 것으로 확인되었고, HIVP는 V. parahaemolyticus에 FIVV는 는 V. vulnificus에만 반응성이 높은 것으로 확인되었다. 정제된 IgY를 이용하여 최적화시킨 indirect ELISA법의 검출한계는 V. parahaemolyticus에 대해서는 105 CFU/mL, V. vulnificus에 대해서는 106 CFU/mL로 확인되었다. 두 균에 대한 IgY 항체는 ELISA와 western blot에서 각각의 면역원에 특이적이고 강한 반응을 보였으나, 모든 Vibrio 균에 대해서 약한 교차반응을 보였다. 표지물질(tracer)과 결합한 다클론성 항체는 항원-항체의 복합적인 반응을 정량적으로 분석하는 화학분석법 시스템에서 2차 항체의 역할을 한다. 미 발견된 몇몇의 물질을 제외하고는 대부분의 2차 항체는 상업적으로 이용되고 있다. 본 연구의 part I에서 anti-quail IgY-HRP는 현재까지 판매되지 않고, 메추라기의 IgY를 측정하기 위해 anti-chicken IgY-HRP를 대신 사용하였기 때문에, part II에서는 anti-quail IgY를 생산한 후 HRP 합성시켜 ELISA법에 사용하여 민감도 향상여부를 확인하였다. 이러한 연구를 위해, part II에서는 마우스에서 anti-quail IgY를 생산하였고, ELISA 시스템에서 quail IgY와 anti-mouse IgY-HRP의 중간 매개체로서의 응용에 관한 연구를 수행하였다. 생산된 마우스 anti-quail IgY를 HRP와 합성시킨 후 SDS-PAGE를 통해 합성을 확인하였으며, 그 작용여부를 ELISA를 이용하여 일반 anti-chicken IgY-HRP와 비교분석하였다. 마우스에서 anti-quail IgY는 성공적으로 생산되었으며, ELISA시스템에서 1:10,000배 희석 후에도 중간역할 항체로 이용이 가능하였다. 추가로, HRP를 결합시킨 마우스 anti-quail IgY의 경우 1:10,000배 희석 후에도 2차 항체로서 기능을 유지하고 있었다. SDS-PAGE결과 마우스anti-quail IgY-HRP가 합성이 원활히 이루어진 것으로 확인되었다. HRP와 합성한 마우스 anti-quail IgY와 합성하지 않은 항체를 이용하여 ELISA를 최적화한 결과 part I에서 상업화된 2차항체로 최적화한 ELISA법과 동일한 검출한계를 나타내었다(V. parahaemolyticus에 105 CFU/mL, V. vulnificus에 대해서는 106 CFU/mL). 메추라기의 경우 그 크기가 작기 때문에 생산하는 메추리알의 사이즈도 작고, 메추리알의 난황 또한 양이 적기 때문에, part I에서 생산된 IgY는 소량의 양이 요구되는 검출도구로 사용하는 것이 적합한 것으로 판단된다. 따라서 IgY의 항균효과를 확인하기 위해서는 암탉에 포르말린 처리하여 사균화시킨 V. parahaemolyticus와 V. vulnificus을 이용하여 면역을 시킨 후 계란을 생산하고 계란의 난황을 정제하여 사용하였다. Part I에 사용한 water dilution/ammonium sulfate 침전법을 사용하여 계란의 난황을 정제하여 IgY를 획득하였다. 생산된 IgY는 사용된 면역원에 강한 반응을 나타냈으며, 총 IgY 함량과 특이 IgY의 함량을 indirect ELISA법으로 측정하였다. 두 비브리오균의 생육억제와 이에 대한 보호효과는 균 배양액과 마우스에 투여하는 방법으로 확인하였다. 닭의 첫 번째 면역 후 28일째 높은 역가를 나타냈으며, 총 단백질량과 총 IgY량은 전체 면역기간동안 안정적으로 생산되었다. 특이 IgY의 경우는 첫 번째 면역 후 49일째 가장 높은 역가에 도달했으며 이후 3주동안 최대 역가를 유지하였다. 비브리오 특이 IgY(150 mg/mL)는 동일한 농도의 IgY와 비교 시 비브리오 균을 액체배양 시 상당히 억제시키는 것으로 확인되었다. 비브리오 특이 IgY를 마우스에 경구 투여한 실험군의 변에서는 PBS와 일반 IgY를 투여한 마우스의 변보다 상당히 낮은 수치의 비브리오균이 확인되었다. 추가적으로 anti-V. parahaemolyticus와 anti-V. vulnificus IgYs를 각각 투여한 마우스의 경우 75%와 87%의 생존율을 보였으나, 일반 IgY와 PBS를 투여한 마우스는 균을 경구투여한 지 3일 이내에 사망하였다. 그러므로 비브리오 특이 IgY가 상당한 항균효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 in vitro와 in vivo 결과는 난황에서 생산된 IgY의 예방효과 및 치료효과를 뒷받침할 수 있을 것이다.

Pseudomonas fluorescens BM07에서 2-Bromooctanoic acid를 이용한 치환된 Medium-Chain Fatty Acids의 Polyhydroxyalkanoic Acid로의 효과적인 전환에 대한 연구

황혁 慶尙大學校 産業大學院 2004 국내석사

2-Bromooctanoic acid (2-BrOA) specifically inhibits the formation of polyhydroxyalkanoic acid (PHA) in Pseudomonas fluorescens BM07 without any influence on the cell growth when grown on fructose (Lee et al., Appl. Environ. Microbiol. 67: 4963-4974, 2001). We extended our study to the structurally analogous medium-chain fatty acid, octanoic acid, and two phenyl-group-substituted carboxylic acids, 11-phenoxyundecanoic acid (11-POU) and 5-phenylvaleric acid (5-PV). When supplemented with 50 mM fructose, these carboxylic acids also suppressed the formation of PHA from fructose, the phenyl-group substituted acids showing a higher sensitivity, but instead their β-oxidation derived monomers were efficiently polymerized. Their conversion into PHA approached a maximum or saturation conversion at high acid substrate concentrations. Especially, the co-addition of 2-BrOA incorporated the β-oxidation derived monomers more effectively at low level of the acid substrate than at highly saturated suppressing level. The addition of 5 mM 2-BrOA to 2 mM 11-POU plus 50 mM fructose resulted in 100% conversion of the 11-POU into PHA. But at the substrate concentration exhibiting saturation (e.g., 5 mM for 11-POU) the effect was not significant over the range of 2-BrOA concentration up to 5 mM. These 2-BrOA-concentration dependent conversion data indicate that the acid substrate-derived inhibiting species bind to the same site as 2-BrOA does. In addition, the growth of the bacterium in a medium containing 20 mM 5-PV and 50 mM fructose resulted in poly(3-hydroxy-5-phenylvalerate) homopolymer, indicating a complete blocking of the monomer-precursor supplying originated from fructose throughout the cultivation. Thus it is suggested that 2-BrOA can be used for efficiently increasing the conversion of expensive substituted fatty acids into PHA.

Study on Host-Induced Gene Silencing in the Interactions of Rice Plant and Rice Blast Fungus, Magnaporthe oryzae

진병준 경상국립대학교 대학원 2021 국내박사

Small RNA 는 대표적인 non-coding RNA 의 한 종류이며, 식물에서는 hairpin RNA (hpRNA) 와 double-stranded RNA (dsRNA)로부터 20-30개의 염기로 이루어진 micro RNA (miRNA) 와 small interfering RNA (siRNA) 가 형성되어 염기서열 상보성에 의한 유전자 발현 억제 현상인 RNA 간섭 현상 (RNA interference; RNAi) 을 일으킨다. 한 세포에서 발생된 small RNA 는 세포 및 조직간 연결망을 통해 광범위하게 이동하며, 이러한 특성을 통해 식물의 개화, 발달, 다양한 스트레스에서 식물의 반응을 조절하는 신호물질로써 중요한 역할을 수행한다. 오늘날 숙주유래 유전자발현억제 (host-induced gene silencing; HIGS) 현상으로 규정되는 식물 small RNA 이동과 병원체의 RNAi 현상은 기존 저항성 연구의 주요 한계점인 저항성 개체의 높은 출현빈도와 저항성 유전자원의 도입 및 고정에 드는 시간과 노동력을 획기적으로 절감시킬 새로운 저항성 개체 개발 전략으로 주목 받고 있다. 이미 미국과 유럽, 중국등의 주요 농업 생산국에서는 주요 식량 및 환금작물들을 대상으로 그 제작방법들과, 환경위해성 평가에 관한 연구들도 활발히 이루어지고 있다. 따라서 본 연구는 벼와 벼 도열병 곰팡이의 HIGS 현상을 규명하고 이를 응용하여 벼의 도열병 곰팡이 저항성을 개선할 수 있는지를 평가하고자 하였다. 첫번째로, 벼와 도열병 곰팡이 간의 HIGS 현상을 규명하였다. small RNA는 소포체 (vesicle) 의 내·외식세포 작용 (endo- and exocytosis) 를 통해 이동한다는 기 연구결과에 근거하여, 벼의 small RNA도 도열병 곰팡이와의 상호작용이 가능한 포자의 부착과 발아 (1 단계), 세포 침투체 형성 (2 단계), 균사체 형성 (3 단계) 과정에서 이동할 수 있다는 가설을 수립하였다. 다음으로 유전자 발현 검증용 형광 단백질인 enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)를 발현하는 형질전환 벼 도열병 곰팡이 계통인 KJ201::eGFP 와 eGFP의 siRNA를 발현하는 형질전환 벼인 35S::dsRNAi_eGFP 벼와의 병원성 상호작용을 관찰하였다. 그 결과, 벼 세포의 표면과 내부에 형성된 대부분의 곰팡이 병원체 구조들이 대조군에 비해 현저히 낮은 eGFP 발현을 나타냄을 정량적, 정성적으로 확인하였다. 이를 통해 HIGS가 벼와 도열병 곰팡이의 상호작용에서도 일반적인 현상임을 확인하였다. 다음으로, 도열병 곰팡이의 병원체 발달 단계를 조절하는 RGS1 (포자의 부착과 발아, 1 단계), MgAPT2 (세포 침투체 형성, 2 단계), LHS1 (균사체 형성, 3 단계)의 HIGS가 벼와 도열병 곰팡이의 상호작용을 어떻게 조절하는지 검증하였다. 먼저, 비 특이적 유전자 발현 억제 효과 (off-target effect)가 가장 적은 cDNA 염기서열 부분을 in silico 방식으로 추출하였고, 각 유전자들의 35S::dsRNAi 벡터를 제작하여 각 곰팡이 병원성 유전자에 특이적인 siRNA를 발현하는 형질전환 벼를 제작하였다. 각 형질전환 벼의 잎과 뿌리, 전신감염 (systemic infection)에 대한 결과는 HIGS 현상이 병 진행의 후반부 조절자일수록 더 강하며, 1단계 조절 유전자인 RGS1의 발현감소는 오히려 저항성을 감소시켰고, 2, 3 단계 조절 유전자인 MgAPT2 와 LHS1 의 발현 감소는 감소량에 비례하는 뚜렷한 저항성 증가가 확인되었다. 마지막으로, 곰팡이 병원성 유전자의 HIGS에 의한 벼와 도열병 곰팡이의 상호작용 변화를 구체적으로 검증하였다. 35S::dsRNAi_MgAPT2 및35S::dsRNAi_ LHS1 벼의 감염된 세포들을 현미경으로 관찰한 결과들은 곰팡이의 발달이 결손 돌연변이체(deletion mutant) 곰팡이(ΔMgapt2, Δlhs1)와 유사했지만, 저항성 granule의 전신적 형성 (systemic accumulation)과 벼의 주요 저항성유전자인 OsPR1a와 OsPR10의 독특한 발현 변화는 HIGS를 통해 벼가 새로운 방식의 저항성을 획득할 수 있음을 보여 주었다. 또한 35S::dsRNAi_RGS1 벼의 저항성 감소는 벼의 저항성 발현이 억제되고, 곰팡이 균사체의 (Invasive hyphae; IH) 발달 및 세포침투(penetration) 능력의 증가가 원인임을 알 수 있었으며, 기존의 ΔMorgs1 곰팡이 연구에서 제시된 병원성 증가 가능성을 HIGS를 통해 증명하였다. 본 연구를 통하여 HIGS는 벼에서도 일반적인 현상이며, 벼의 도열병 저항성 개선을 위한 HIGS의 응용방법을 유전자원의 선별법, 벡터 제작법 및 저항성 검증법으로 나누어 구체적으로 제시하였다. 또한, HIGS는 기존의 보고된 방법과 다른 방식으로 식물-곰팡이 상호작용을 조절함을 구체적으로 증명하여 HIGS기반의 새로운 곰팡이 유전자 기능 연구법을 제시하였다. 본 연구결과들의 지속적인 응용을 통해 향후 HIGS의 농업적, 생물학적 활용을 위한 제반기술들을 선도적으로 확보할 수 있을 것으로 사료된다. In plants, small RNAs including microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs) play crucial roles in RNA interference (RNAi) in a cell-autonomous and non-cell-autonomous manner. Recently, host-induced gene silencing (HIGS) has been applied for the successful control of fungal pathogens in various crops. Although, the study of HIGS between rice and rice blast fungus, which is the main biological causal agent of global rice yield, is still elusive in major producing countries of Asia. Encouraged by this inactivity, in this study, HIGS of rice blast fungus, Magnaporthe oryzae, and novel functions of fungal pathogenic genes were suggested. First, using eGFP gene and 35S::dsRNAi vector system, a cytological system to verify HIGS between rice and rice blast fungus was developed and the HIGS of M.oryzae was successfully established. Next, to apply HIGS to the enhancement of rice resistance against M.oryzae, fungal pathogenic genes specifically regulating the main infection stages, such as RGS1, MgAPT2, and LHS1 were selected. HIGS of MgAPT2, and LHS1, which have critical roles in appressorial penetration and hyphal development, respectively, successfully changed compatible interaction between rice plants and M. oryzae to incompatible, resulting in the enhanced tolerance of rice plants to rice blast fungus. In contrast, HIGS of RGS1, regulating conidium germination and appressorium initiation enhanced fungal pathogenicity, which was antagonistic to a previous study conducted with ΔMorgs1 mutant fungus. Moreover, the molecular mechanisms underlying the effects of HIGS of RGS1, MgAPT2, and LHS1 genes on interaction between rice plants and M. oryzae was also studied. Different patterns of granulation, callose deposition, and ROS generation in 35S::dsRNAi rice plants during blast infection suggest novel roles of the three pathogenic genes related to modulation of host defense system. In sum, this study suggests not only the optimal target genes for efficient HIGS of the rice blast fungus to protect whole rice plants from rice blast infection, but also a novel aspect in studying functions of fungal pathogenic genes during interaction between rice and rice blast fungus.

Escherichia coli와 Streptococcus thermophilus 균주의 글루탐산 탈탄산효소 분비 발현 및 GABA 생성에 의한 생물학적 활성

김민수 경상국립대학교 대학원 2022 국내박사

Gamma-amino butyric acid는 인간의 뇌와 눈에 풍부하게 발현되는 4개의 탄소로 이루어진 비단백질 아미노산이며, 동물에서 고혈압과 이뇨 작용을 하는 주요 억제성 신경전달물질로 작용한다. Gamma-amino butyric acid는 식품 및 의약품에서 생리활성 성분의 잠재력으로 인해 동물신경의 이완을 촉진하고 신경 긴장을 완화하는 기능성 식품의 성분으로 활용되었다. 따라서 본 연구에서는 여러 대장균 균주들에서 (E. coli DH5α, E. coli W3110, E. coli JM109) GadA 및 GadB 유전자(gadA 및 gadB)를 T-vector에 클로닝하고, 염기서열 분석에 의해 GenBank에 등재되어 있는 서열과 비교하며, 각 균주의 gadA 및 gadB의 효과적인 발현을 위하여 T7 promoter를 함유하는 pT7-7 발현시스템에 유전자들을 도입하여 각 균주간의 GAD (GadA 및 GadB)들의 발현율 차이 및 효소 활성을 비교 분석 한다. 또한 발현 최적화 조건을 확립하여 대량생산에 의한 굴절체를 확보한 다음, 부분정제 과정을 통한 효소 순도를 향상시켜 GABA 전환율을 비교 분석하고, 가장 효율적인 GAD를 확보하였다. 마지막으로 전환 생성된 GABA의 생물학적 활성을 조사하여 산업적 응용범위 확대를 위한 기초 및 응용 자료를 도출하려 하였다. 우선적으로 GenBank에 등재 되어있는 GAD 염기서열을 [E. coli strain. K-12 substrain. MG1655 (GenBank accession No. NC000913 및 NP_417974.1)] 참고하여 특이서열의 primer set를 합성하고 주형으로는 E. coli W3110, DH5α, 및 JM109 균주들의 colony 또는 염색체 DNA를 사용하여 PCR 증폭에 의해 GAD 유전자들 (gadA 및 gadB)을 확보하고 pGem-T easy vector로 클로닝하여 DNA 염기서열 분석에 의해 도입된 gadA 및 gadB 유전자들을 최종적으로 확인하였고, T-gadA 및 T-gadB (4.4 kb)로 명명하였다. 각 균주들 간의 염기서열은 gadA의 경우에는 서로 일치하는 서열을 가지고 있으나, gadB의 경우에는 W3110 유래의 경우 GenBank gadB (Accession No. BAA15163.1)의 서열과 비교 할 때 401번째 아미노산 leucine401 (CTG)이 proline401 (CCG) 으로 바꼈고, 또한 444번째 아미노산 serine444 (TCT)이 serine444 (TCC)으로 silent mutation 된 것으로 나타났다. Glutamate decarboxylase 유전자의 CDS는 1,401 bp로 구성되며 466개의 아미노산에 대한 정보를 가지며 분자량은 51.2 kDa으로 추정되었다. 각 균주로부터 GadA 아미노산 서열과 GadB 서열은 466개 아미노산 중 5군데, 즉 GadA의 경우Gln3, Leu5, Leu6, Phe9, 및 Ala22, GadB의 경우 Lys3, Gln5, Val6, Leu9, 및 Ser22에서만 차이가 나며 나머지 부분에서는 동일한 서열을 갖는 것으로 분석되었다. Glutamate decarboxylase isoform (GadA 및 GadB)들의 균주간 발현율 및 효소 활성 차이를 알아보기 위하여 강력한 T7 (T7 bacteriophage) promoter를 지니는 pT7-7 vector (2.43 kb)로 gadA 및 gadB 유전자들을 도입하여 재조합 발현벡터를 구축하고, gadA 및 gadB 유전자가 in frame하에 도입된 것을 확인하였고, pT7-gadA 및 pT7-gadB (3.87 kb)로 명명하였다. W3110 유래 gadA 및 gadB는 pT7-gadA4와 pT7-gadB14, DH5α 유래 gadA 및 gadB는 pT7-gadA11와 pT7-gadB2로, JM109 유래 gadA 및 gadB는 pT7-gadA2와 pT7-gadB7으로 명명하였다. 대장균 W3110으로부터 유래된 gadA 및 gadB를 포함하는 발현벡터, pT7-gadA4 (형질전환체 A4-1), pT7-gadA18 (형질전환체 A18-1), pT7-gadB14 (형질전환체 B14-1)의 경우 전체 단백질 중 차지하는 GadA 및 GadB 비율은 30℃에서는 8-15% 정도로 분석되었고, 37℃에서는 6-9% 정도로 densitometer 측정에 의해 분석되었다. 대장균 DH5α로부터 유래된 gadA 및 gadB를 포함하는 발현벡터 pT7-gadA11의 형질전환체 (A11-1, A11-2), pT7-gadB2의 형질전환체 (B2-1, B2-2)의 경우 전체 단백질 중 차지하는 GadA 및 GadB 비율은 30℃에서는 16-21% 정도로 분석되었고, 37℃에서는 8-12% 정도로 densitometer 측정에 의해 분석되었다. 대장균 JM109로부터 유래된 gadA 및 gadB를 포함하는 발현벡터 pT7-gadA2의 형질전환체 (A2-1, A-2), pT7-gadA16의 형질전환체 (A16-1, A16-2), pT7-gadB7의 형질전환체 (B7-1, B7-2)의 경우 전체 단백질 중 차지하는 GadA 및 GadB 비율은 30℃에서는 19-22% 정도로 분석되었고, 37℃에서는 12-13% 정도로 densitometer 측정에 의해 분석되었다. 따라서, 발현 시 온도는 W3110, DH5α에서와 마찬가지로 30℃가 적절한 것으로 판단되며, 또한 배양시간도 24 h 보다는 6 h가 발현에 더 적합한 것으로 나타났으며, W3110와 DH5α 유래 유전자들의 발현 보다는 평균적으로 효율이 더 좋은 것으로 보이지만, 그 차이는 그렇게 크지 않으므로 배지 및 배양 조건. 발효기, 탄소 및 질소원, mineral, aeration, impella 회전속도 등 최적화에 의해 발현량을 증가 시킬 수 있을 것이다. Glutamate decarboxylase에 의한 GABA 전환율은 JM109 유래 gadA에 대한 (pT7-gadA2-1) supernatant에서 GABA전환율은 100% 이며, pellet의 경우도 100%를 나타내고, gadB에 대한 (pT7-gadB7-1) supernatant에서 GABA전환율은 100% 이며, pellet의 경우 100%를 나타내므로 JM109 유래의 효소 GadA 및 GadB의 활성은 supernatant 및 pellet에서 100% 작동하는 것으로 나타났다. 항산화 활성을 위한 GadA 효소는 JM109유래의 유전자를 포함하는 pT7-gadA2-1 벡터를 함유하는 E. coli BL21(DE3)pLysE에서 생산하였으며 (1,250 μg/mL), GadB 효소는 높은 GABA 전환 활성을 보이는 DH5α 유래의 pT7-gadB2-1 벡터를 함유하는 E. coli BL21(DE3)pLysE에서 발현 생산하였다 (1,457 μg/mL). 대조군으로 사용한 ascorbic acid의 경우 50% 정도의 항산화활성을 보였으며, 반면에 GadA의 경우는 53%, GadB의 경우에는 60% 정도의 항산화 활성을 보여 대조군보다 각각 3% 및 10% 정도의 항산화 활성이 증가한 것으로 나타났다. 세포생존율은 positive control로 사용한 GABA standard (5 mg/mL)의 경우 세포 생존율을 16% 복구시켰으며, 부분정제한 GadB (5 mg/mL)에 의해 전환된 GABA를 30 μL (150 μg) 처리하였을 때도 15% 정도 세포생존율이 복구되는 것으로 확인되었다. 따라서 GABA의 생리적 활성 중에서 비록 세포 수준이지만 제1형 당뇨에서 파괴되는 β-cell의 생존복구율을 증가 시킬 수 있는 가능성이 있음을 시사한다. 또한 NO 생성량의 억제효과는 positive control로 사용한 GABA standard 처리구에서는 STZ 처리로 당뇨를 유발하였을 때보다 산화질소의 발생량이 4배 정도 감소하였다. 또한 GABA (by GadB from E. coli BL21(DE3)pLysE/pT7-gadB2-1)를 30 μL (150 μg GABA) 처리 하였을 때 STZ 처리시 산화질소 발생량의 4.96배 정도 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 대장균에서 발현 생산한 GadA 및 GadB의 경우 발현 최적화에 의해 대량생산을 꾀하고, 정제과정을 단순한 방법으로 개선하고 입증된 여러 생리활성들을 잘 활용한다면 산업화에 적용 가능성이 높은 잠재력을 나타낼 수 있다고 평가한다. Streptococcus thermophilus는 GAD (gadB)와 glutamate/GABA antiporter (gadC) 관련 유전자를 지니며, S. thermophilus 염색체부터 gadB유전자의 클로닝, GAD의 단백질 발현 및 분비, GABA 생성능과 생물학적 활성을 확인하기 위해 primer set 합성과 함께 PCR에 의해 유전자를 증폭하였다. 유전자 gadB의 CDS는 1,377 nucleotide로 구성되어 459 아미노산에 대하여 암호화하며 예상 분자량은 52.6 kDa이다. 배양액에 효소를 분비하여 직접적으로 glutamate를 GABA로 전환시키는 것이 효소 생산 및 전환 수율 향상을 위하여 효율적이므로 고초균에서 분비능이 확인되고, alkaline protease promoter (aprE-P, 0.45 kb), signal sequence (aprS, 87 bp) 및 리보솜결합서열 (GGAGAGGG)을 갖는 pRBAS 분비벡터에 서열 분석에 의해 확인된 gadB 유전자를 직접적으로 cloning하여 pRBAS-GadB 재조합벡터(7.83 kb)를 구축하고 B. subtilis LKS87에 형질 전환하여 재조합벡터를 함유하는 형질전환체를 확보하였다. 재조합체를 LB배지에서 시간별(12 ~ 48 h)로 배양한 다음, 발효액을 수집하여 SDS-PAGE 및 His-tag에 대한 항체를 사용하여 western blot에 의해 분비된 GAD를 확인하였으며 분비 정도는 전체 분비단백질 중 10 - 12% 정도였으며 배양시간에 따른 균체 증가에 의한 전체 분비된 단백질은 증가하였지만, 분비된 GAD가 차지하는 비율은 배양시간 및 형질전환체에 따라 비슷한 수준으로 분비되었다. 분비 효율적인 면에서 최적화 실험이 추가로 진행되어야 할 필요성은 있지만 활성적인 GAD가 분비되었다는 것을 간접적으로 확인하였다. Glutamate decarboxylase 효소에 의한 GABA 생성율을 paper chromatography에 의해 측정한 결과 GAD가 분비된 배양액의 경우 기질로 사용한 MSG를 약 16% 정도 GABA로 전환시켰으며, cell pellet을 파쇄하여 PBS buffer로 용출하여 분석하였을 때는 약 43% 정도의 GABA로 전환을 보였다. 이는 아직 분비되지 않고 세포내에 남아있는 GAD가 존재하는 것을 의미하며 신호서열 (aprS)의 교체 및 추정의 GAD 자체 분비서열 제거에 의한 분비효율이 개선될 필요성을 보이는 것이다. Glutamate decarboxylase에 의해 전환된 GABA의 생물학적 활성은, ABTS+ 라디칼을 소거하는 항산화 활성이 약 55%로, 일반적으로 알려진 ascorbic acid (50%)보다 좀 더 향상 된 것으로 나타났으며, 당뇨세포주의 제1형 당뇨모델에서 28.2% 정도의 세포 생존복구율을 보였고, 또한 STZ 처리에 의해 생성된 NO 가스 생성을 78.7% 정도 억제함으로써 항당뇨 효과의 가능성을 보였다. 그러나 아직 분비 효율의 최적화에 의한 발현 및 분비율 증가와 분비된 효소활성 증진을 위한 개선이 필요하며 또한 산업적 응용 가능성을 확장하기 위하여 가축 및 반려동물의 항스트레스 제제인 GABA를 함유하는 사료첨가제 개발도 앞으로 중점적으로 연구해야 할 과제로 남는다. Gamma-amino butyric acid (GABA) is produced from monosodium glutamate (MSG) via enzymatic conversion by glutamate decarboxylase (GAD). Gamma-amino butyric acid is a four-carbon non-protein amino acid that is abundantly expressed in the human brain and eye. In mammals, it acts as a major inhibitory neurotransmitter, inducing hypertension and diuresis. Since the low activity of cell preparations has been a major limitation to commercial enzyme synthesis, it is worthwhile to explore methods to obtain a cost-effective recombinant enzyme with high GABA synthesizing activity. Recent studies have shown that GABA is effective in promoting hypotension and anxiety relief, along with acting as a diuretic, antidiabetic, and antidepressant in humans and other mammals. Food and drug research on GABA in humans is being actively conducted worldwide, but research on livestock is limited. In this study, to compare genetic characteristics and enzyme activity of the GADs from various Escherichia coli (E. coli) strains, gadA and gadB genes were amplified using specific primer set, cloned into pGEM-T-Easy vector (T-vector), and the gene sequences were analyzed. The sequences of nucleotide and amino acid are composed of 1,401 bp CDS (coding sequence) and 466 amino acids, respectively and putative molecular weight is expected to be 51.2 kD. And then, the genes (gadA and gadB) were cloned into pT7-7 expression vector, transferred in E. coli BL21 (DE3) pLysE strain, and the expression was optimized according to culture conditions. After partial purification, GABA conversion and its physiological activity was assessed. In experiment 1, E. coli W3110, DH5α, and JM109 strains showing highest GABA production were selected as the target strains. It was found that two isoforms of GAD, encoded by gadA and gadB, were present in E. coli. Above all, gadA and gadB genes were cloned into pGem-T-easy vector after PCR amplification from E. coli colony or chromosome as template, right clones were screened and selected, and finally the clones were named to T-gadA and T-gadB (3.87 kb) as followings: from E. coli W3110; T-gadA4, T-gadB14, T-gadA18; from DH5α: T-gadA11 and T-gadB2, T-gadB-18, P-gadB-7; from JM109 : T-gadA2, T-gadB7, T-gadA16. Among nucleotide sequences of E. coli W3110 gadA and gadB, the sequences of gadA show no difference between strains as that of GenBank (Accession No. NP_417974.1), but the sequence of gadB was changed at 2 positions of amino acid sequence from leucine401 (CTG) to proline401 (CCG) and silent mutation from serine444 (TCT) to serine444 (TCC), referred to gadB (Accession No. BAA15163.1). Otherwise, the sequences of gadA and gadB for E. coli DH5α and JM109 were identical to those of E. coli strain. K-12 substrain. MG1655 (GenBank accession No. NC000913 and NP_417974.1). By multiple alignment for amino acid sequences of GadA and GadB from E. coli W3110, DH5α, JM109 with the sequences of GenBank, the GadA sequence show no difference between strains. And also, the difference between GadA and GadB show only at the positions of 5 amino acid ; that is, Gln3, Leu5, Leu6, Phe9, and Ala22 of the GadA were changed to Lys3, Gln5, Val6, Leu9, and Ser22 of GadB and the rest of them was identical as a result of analysis. To compare different expression levels and enzyme activities of isoforms, intracellular expression of GadA and GadB in E. coli was carried out, the inclusion body was partially purified, and enzyme activity was analyzed by GABA conversion efficiency. The gadA and gadB genes (1.4 kb) cloned into T-vector were obtained after digestion of NdeI and BamHI and introduced into pT7-7 expression vector containing bacteriophage strong T7 promoter. After screening and selection of the right clones, the putative clones were sequenced, the DNA sequence in frame confirmed, and named to pT7-gadA and pT7-gadB (3.87 kb), respectively. The expression vectors such as pT7-gadA4, pT7-gadA18, pT7-gadB14 were constructed from gadA and gadB of W3110 ; pT7-gadA11, pT7-gadB2, and pT7-gadB18 from DH5α; pT7-gadA2, pT7-gadA16, and pT7-gadB7, respectively. The recombinant vectors were transferred into E. coli BL21(DE3)pLys, in which bacteriophage T7 RNA polymerase gene is cloned in chromosome of the strain (lysogen) under control of lac promoter, expressed by induction of IPTG and initiate transcription of target genes (gadA and gadB). When the expressed proteins by IPTG induction were fractionated on 12% SDS-PAGE and percentage of interest proteins for total cell proteins was measured using densitometer, in case of gadA and gadB originated from W3110, the proteins were expressed to be approximately 8-15% at 30℃ and 6-9% at 37℃, indicating that expression levels of GadA or GadB showed better condition at 30℃ and 6 h than 37℃ and 24 h. In DH5α, the levels also showed bettert 30℃ and 6 h (21-22%) than 37℃ and 24 h (8-12%). Finally, in case of gadA and gadB originated from JM 109, the proteins were expressed to be approximately 19-22% at 30℃ and 12-13% at 37℃. Accordingly, it is judged that gadA and gadB originated from JM109 showed slightly better than those of W3110 and DH5α, but expression efficiency may be improved by culture conditions (such as carbon and nitrogen sources, temperature, aeration, fermenter capacity, impella rotatary speed, mineral..etc). To detect the expressed GadA and GadB immunologically, the synthesized oligomer of His-tag (composed of 6 histidine, 5'-CACCATCACCATCACCAT-3') was fused to 3' end of the coding sequence of gadA and gadB. The GadA and GadB was expressed as 6 His additional type of existing GadA and GadB, which can be detected using anti-histidine antibody by western blot analysis. The GABA conversion rate by glutamate decarboxylase was investigated using recombinant GadA and GadB. The supernatant of cell lysates [E. coli BL21(DE3)pLysE containing pT7-gadA2-1 (gadA originated from E. coli JM109)] showed 100% GABA production from monosodium glutamate as substrate and the cell pellet suspended in PBS buffer also showed 100% conversion rate. In case of GadB originated from E. coli JM109, it is appeared to be 100% conversion rate and the pellet was same as above (100% conversion). Accordingly, GadA and GadB originated from JM109 have powerful enzyme activity in both supernatant and pellet. To investigate antioxidant activity, GadA was produced in E. coli BL21(DE3)pLysE containing pT7-gadA2-1 (gadA from JM109) (1,250 μg/mL) and GadB produced in E. coli BL21(DE3)pLysE harboring pT7-gadB2-1 (gadB from DH5α)(1,457 μg/mL). Ascorbic acid as a control showed 50% antioxidant activity, otherwise the activities of GadA and GadB was 53% and 60%, respectively. The activities were increased to 3% and 10% than the control. In insulinoma RINm5F cells, type I-like diabete was induced by streptozotocin and samples were treated to measure cell viability. The viability was restored by GABA standard (5 mg/mL) as positive control, on the other side the partial purified GadB (5 mg/mL) also increased the cell viability to 16% at concentration of 30 μL (5 mg/mL), indicating that the possibility to restore viability of β-cell destroyed in Type I diabetes is existing even though cell level at present. And to inhibit nitric oxide (NO) production, GABA was administrated in insulinoma cell, RINm5F after diabetes induction. When GABA standard was treated, NO production was decreased to 4-fold and the partial purified GABA (by GadB from E. coli BL21(DE3)pLysE/pT7-gadB2-1) also reduced ro 4.96- fold of NO production yield inside the cells. Accordingly, GadA and GadB produced in E. coli BL21(DE3)pLysE will furthermore be optimized to produce high yield of the protein and purification process will be simplified sooner or later. In my opinion, it is estimated that this study will contribute to industrialize and commercialize with high potentials. In experiment 2, Since the low activity of cell preparations in E. coli has been a major limitation to commercial enzyme synthesis, it is worthwhile to look for methods to obtain a affordable recombinant enzyme with high GABA synthesizing activity. In order to maximize production of GABA using the culture broth without purification in Bacillus subtilis, the gene (gadB) first was obtained from chromosome of Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) expressing the GAD with appropriate amount. The primer set with restriction enzyme sites and His-tag was designed by referring to the DNA sequence of glutamate decarboxylase enrolled in GenBank (DQ871217.2), amplified and cloned into pGEM-T-Easy vector. The right clone was screened and characterized by DNA sequencing analysis. As a result, the DNA sequence was different from that of GenBank in codons encoding 4 amino acids (Tyr189, Gly282, Ser301, and Met 425) by point mutations, which were changed to Cys189, Asp282, Gly301, and Thr425, respectively. To secret the GAD in culture medium, the recombinant vector (pRBAS-GadB, 7.83 kb) containing the gadB gene was constructed using pRBAS secretion vector with alkaline protease promoter (aprE-P, 0.45 kb) and signal sequence (aprS, 87 bp) and then transferred into Bacillus subtilis LKS87. The secretion levels of GAD were analyzed by SDS-PAGE and western-blot and the level in B. subtilis LKS87 harboring the pRBAS-GadB vector was increased to approximately 10-12% of total secreted proteins. The conversion of MSG (monosodium glutamate) to GABA was measured by paper chromatography using the culture broth and PBS-eluted cell pellet. As a result, the culture broth shows 16% GABA conversion rate from MSG, whereas the pellet shows higher conversion (~43%), indicating that the expressed GAD was not sufficiently secreting into the culture broth caused by the inefficient processing of aprS signal sequence or presence of self signal sequence of the GAD gene. By measuring the ABTS+ scavenging ability, it was confirmed that the GABA converted by GAD showed higher antioxidant activity (55%) than that (50%) of ascorbic acid used as positive control. The survival recovery rate of STZ-treated RINm5F cells was increased to 28.2% by the GABA treatment and also, production of NO was drastically reduced with 78.7% in STZ-treated RINm5F cells, suggesting that the GABA possess antidiabetic and antioxidant activities. Finally, although GABA is showing various biological activities, it might be needed to optimize secretion efficiency for industrial applications.

사막이리응애(Neoseiulus californicus) (응애아강: 이리응애과)의 대량 사육 및 현장적용

황활수 경북대학교 대학원 2025 국내박사

사막이리응애[Neoseiulus californicus (McGregor)]는 원예작물의 주요 해충인 점박이응애(Tetranychus urticae Koch) 방제를 위해 개발된 포식성 천적이다. 이 종은 고온에 강하며 광식성이기 때문에 응애류뿐만 아니라 가루이 및 총채벌레와 같은 다른 해충 방제에도 사용되고 있다. 국내의 경우, 점박이응애의 천적으로서 주로 칠레이리응애(Phytoseiulus persimilis)가 사용되지만, 사막이리응애의 활용률은 낮은 편이다. 본 연구에서는 사막이리응애의 효율성을 검정하기 위하여 간편한 사육 기술을 개발하고 최대 증식을 위하여 먹이 및 사육 용기 등 다양한 조건을 분석하였다. 또한, 자가 생산한 사막이리응애를 활용하여 딸기와 참외 재배지에서 점박이응애 방제 실증시험을 하여 그 방제효능을 분석하였다. 사막이리응애의 간편한 자가 생산을 위하여 멸균 파우치를 개발하였다. 멸균 파우치의 앞면은 내부의 증식을 관찰하기 위하여 투명한 비닐을 사용했고 뒷면은 가스교환을 위하여 종이를 활용하여 제작하였다. 제작된 멸균 파우치(1L, 21×29cm) 안에 사막이리응애(0.5-5마리/ml)와 먹이원인 가는다리고기진드기(Lepidoglyphus destructor)(2,000마리/ml)를 넣고 봉한 후에 플라스틱 상자와 네오박스안에 두고25±1℃, 90±5% 상대습도 조건에서 2주간 사육하였다. 그 결과, 사막이리응애의 밀도는 12배까지 증가했다. 또한, 먹이원에 따른 사막이리응애의 증식율을 분석하기 위하여 재배지의 주요 먹이원인 점박이응애와 인공증식에 사용하는 먹이원인 가는다리고기진드기를 대상으로 사막이리응애의 성장, 발달 및 생식에 미치는 영향을 비교하였다. TWOSEX-MSChart와 TIMING-MSChart 프로그램을 활용하여 사막이리응애의 생명표를 분석한 결과, 사막이리응애의 유한 증가율(λ)은 점박이응애와 가는다리고기진드기 먹이원에 따라 각각 1.32와 1.17로 유의미한 차이를 보였다. 사막이리응애의 밀도가 2배 증가하는 시간은 점박이응애를 먹이원으로 사용할 경우 2.5일, 가는다리고기진드기를 먹이원으로 사용할 경우 4.4일로 확인되었으며, 점박이응애를 먹이원으로 사용할 때 가는다리고기진드기에 비해 증식 시간이 약 0.57배로 더 짧았다. 하지만, 먹이응애 증식조건에 있어서 점박이응애는 식물(콩)에 증식해야 하지만 가는다리고기진드기는 별도의 식물을 재배할 필요 없이 밀기울과 메밀 씨앗 등을 이용한 인공배지에서 증식할 수 있기 때문에 가는다리고기진드기 증식조건이 훨씬 더 경제적이고 효율적이었다. 자가생산한 사막이리응애를 활용하여 딸기와 참외 농가에서 점박이응애의 방제 효과를 분석하였다. 딸기 농가에서는 10마리/m² 수준으로 매주 1회씩 9주간 엽면 살포한 결과 점박이응애 밀도가 유의미하게 감소하였다. 참외 농가에서는 5마리/m²로 매주 1회씩 7주간 살포한 결과, 점박이응애 밀도가 무처리구에 비해 83.2% 감소하였다. 또한, 딸기 농가에서 사막이리응애와 칠레이리응애의 방제 효과를 비교한 결과, 무처리구의 점박이응애 밀도가 17.4마리/잎인 반면에 천적 처리구는 0.2-0.5마리/잎으로 나타났다. 즉, 포식성 천적의 생물적 방제 효과는 상당히 높은 효과를 나타냈으며 포식성 응애 2종의 방제 효과는 유사한 수준으로 나타났다. 본 연구 결과는 점박이응애 방제를 위하여 사막이리응애를 간편한 방법으로 자가 생산하여 효과적으로 활용할 수 있는 기술을 실증하였으며 국내 천적 농법의 활성화에 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.

식물내생세균 Burkholderia cepacia EB215로 부터 분리한 항균물질의 특성규명

박지현 慶尙大學校 大學院 2004 국내석사

식물 내생세균을 이용한 채소병 방제용 미생물살균제를 개발하기 위하여 고추, 오이 등의 5가지 식물체의 여러 건전 조직으로부터 총 260개의 식물내생세균을 분리하였다. 항균활성이 있는 균주를 선발하기 위하여 분리한 260개의 식물내생세균을 토마토 역병(P. infestans), 오이 탄저병(C. orbiculare), 토마토 잿빛곰팡이병(B. cinerea), 보리 흰가루병(B. graminis f. sp. hordei) 및 오이 모잘록병(P. ultimum) 등의 5가지 식물병에 대하여 in vivo 항균활성을 조사하였다. 그 결과, 총 50개의 균주가 5가지 식물병 중 1가지 이상의 식물병에 대해 90% 이상의 방제활성을 보였다. 이렇게 효과가 우수한 균주들에 대해서는 그 균주들의 액체 배양액을 3배와 9배로 희석하여 다시 항균활성을 검정하였다. 그 결과, 토마토 역병에 대해서는 EB072와 EB215 균주가 높은 항균활성을 보였으며, 3배 희석액 처리시 두 균주 모두 70% 이상의 방제가를 보였다. 오이 탄저병에 대해서는 희석 배수를 달리하여도 EB040균주와 EB052균주, EB081, EB102, EB215 등의 균주가 비교적 우수한 항균활성을 보였다. 보리 흰가루병에 대해서는 EB072균주와 EB081, EB120균주가 높은 항균활성을 보였고, 오이 모잘록병에 대해서는 EB055균주와 EB056, EB069, EB102 균주가 높은 항균활성을 보였으며 9배 희석액 처리시 네 균주 모두 70% 이상의 방제가를 보였다. EB072균주와 EB081, EB102 균주의 경우에는 2가지 이상의 식물병에 대하여 우수한 항균활성을 보였다. 이중 오이 탄저병에 대하여 효과가 우수한 균주들에 대하여 고추 탄저병원균인 C. acutatum에 대한 대치배양을 실시하였다. 그 결과 EB054균주와 EB081, EB151, EB215균주가 우수한 활성을 보였으며, 그 중에서도 EB215가 가장 높은 활성을 보였다. In vivo에서 오이 탄저병에 대하여 효과가 우수하게 나타났고, 또한 in vitro에서 고추 탄저병균의 균사 생육에 대하여 높은 항균활성을 보인 식물내생세균인 EB215 균주로부터 항균물질의 분리 및 동정을 실시하였다. EB215 균주는 여러 생리·생화학적 특성 조사와 Biolog test, 16S rDNA sequence 결과들을 종합하여 Burkholderia cepacia로 동정되었다. 대량 배양한 B. cepacia EB215 균주의 추출물로부터 silica gel column chromatography와 preparative TLC 등을 통하여 하나의 활성물질을 순수 분리하였으며, 구조 동정을 위해 질량분석과 핵자기 공명분석을 실시한 결과 pyrrolnitrin으로 동정되었다. B. cepacia EB215로부터 분리한 pyrrolnitrin은 고추 탄저병, 벼 도열병 및 벼 잎집무늬마름병에 대해서는 11.1 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 90% 이상의 방제활성을 나타내었고, 오이 탄저병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 밀 붉은녹병에 대해서는 33.3 ㎍/㎖ 이상의 농도 이상에서 90% 이상의 방제활성을 보여 주었다. 이러한 결과들은 각각의 기존 약제들과 그 효과가 유사하거나 더 우수하였다. In order to develop a new microbial fungicide for the control of vegetable diseases using endophytic bacteria, a total of 260 bacterial strains were isolated from fresh tissues of 5 plant species. After they were cultured in broth media, their antifungal activities were screened by in vivo bioassays against Botrytis cinerea(tomato gray mold), Pythium ultimum(cucumber damping-off), Phytophthora infestans(tomato late blight), Colletotrichum orbiculare (cucumber anthracnose) and Blumeria graminis f. sp. hordei(barley powdery mildew). As the results of screening, 50 bacterial strains showed potent antifungal activities more than 90% against at least one of 5 plant pathogens. After liquid cultures of these strains were diluted 3 and 9 times, their antifungal activities were rescreened against 5 plant diseases. As the results of rescreening, EB072 and EB215 strains showed a potent antifungal activitity against tomato late blight, EB040, EB052, EB081, EB102 and EB215 against cucumber anthracnose, EB072, EB081 and EB120 against barley powdery mildew and EB055, EB056, EB069 and EB102 against cucumber damping-off. Bacterial strains EB072, EB081 and EB102 displayed potent disease control activities against more than 2 plant diseases. Among the bacterial strains with a potent antifungal activity against cucumber anthracnose, four bacterial strains, EB054, EB081, EB151 and EB215, also displayed a potent in vitro antifungal activity against Colletotricum acutatum, a fungal pathogen causing pepper anthracnose. A bacterial strain EB215 displayed the most potent antifungal activity among the four strains. A bacterial strain EB215 obtained from cucumber roots was identified as Burkholderia cepacia based on its physiological and biochemical characteristics, Biolog test and 16S rDNA gene sequence. An antifungal substance was isolated from the liquid cultures of B. cepacia EB215 strain by n-hexane partitioning, repeated silica gel column chromatography, and in vitro bioassay. Its chemical structure was determined to be pyrrolnitrin by mass and NMR spectural analyses. Pyrrolnitrin showed potent disease control activities more than 90% against pepper anthracnose, rice blast and rice sheath blight at 11.1 ㎍/㎖. In addition, it controlled against cucumber anthracnose, cucumber gray mold and wheat leaf rust at 33.3 ㎍/㎖ over 90%.

Generation of transgenic rice plants to improve heat tolerance : 애기장대 유래 비생물학적 스트레스 저항성 유전자들을 이용한 고온 저항성 벼 형질전환체 육성

이다솜 경북대학교 대학원 2019 국내석사

Plants are exposed to a variety of environmental stresses as they grow, and these stresses affect plant growth. Global warming due to climate change and extreme weather change have a negative impact on agriculture and cause reduced crop yields. Thus, enhancing the plant’s abiotic stress resistance will improve plant production by maintaining plant growth and development even under severe environmental conditions. To enhance the high temperature stress resistance of rice, I investigated the abiotic polymorphism of HSP101 and CBF1 derived from the Arabidopsis thaliana by using the TDF1, OsLPS1, and UBQ14 promotors, which induce transgenic expression. Agrobacterium-mediated tissue culture was performed using the mature rice seeds of Dongjin to induce callus and transgenic rice plants were generated through regeneration process. Gene transfer was confirmed by PCR analysis of T0 and T1 plant genomic DNAs. These overexpression lines will be tested at vegetative stage and reproductive stages in the T2 generation. Studies on genes that are effective in promoting high temperature resistance of various candidate genes are expected to be useful as basic data for improving rice cultivars against global warming in the future.

Molecular Characterization of Thiol-based Redox Sensors in Plants

위성동 경상국립대학교 대학원 2022 국내박사