식품에서 Helicobacter pylori 신속 검출을 위한 real-time PCR과 loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 방법의 개발

국문 초록 (Abstract)

Helicobacter pylori는 만성 위염의 주요 원인이며, 위암의 발생과도 관련이 있다. 감염 경로는 주로 배설물과 구강을 통해 이루어지며 동물 유래 식품과 즉석식품에서 오염이 보고된 바 있다. 식품에서 신속하고 정확한 H. pylori 검출을 위해 real-time PCR (rt-PCR)과 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 방법을 개발하였다. Target 유전자로 heat shock protein 60 gene (hsp60)에 특이적인 2 primers (for rt-PCR)와 4 primers (for LAMP)를 제작하였다. 두 primer sets로 총 42종의 bacterial DNA와 사람을 포함한 6종의 동물 DNA에 대해 specificity를 확인하였다. 또한 rt-PCR과 LAMP의 검출한계는 각각 101 CFU/rxn 및 102 CFU/rxn 이었다. 멸균우유에 H. pylori를 인위적으로 spiking하여 검출한계를 조사한 결과 역시 동일한 결과를 얻었다. 확립된 조건으로 국내 젖소 목장에서 수거한 원유 총 12 개 샘플에 적용한 결과 9개의 원유 샘플에서 양성반응을 보였다. 따라서 본 연구에서 개발한 두 방법은 식품에서 H. pylori의 신속 검출에 활용이 가능할 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Helicobacter pylori infection is associated with chronic gastritis, ulcers, and gastric cancer in humans. H. pylori can be spread by contaminated food or water. Real-time PCR (rt-PCR) and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) methods were developed for the rapid detection of H. pylori in food. Two primers and one probe (for rt-PCR) as well as four primers (for LAMP) were designed to specifically detect the heat shock protein 60 gene (hsp60) of H. pylori. The specificities of both assays were determined for 17 H. pylori strains, 19 non-target bacterial strains and 6 animal species including human. Among them, all were positive for the examined H. pylori strains. The detection limits of rt-PCR and LAMP assays were 101 CFU/rxn and 102 CFU/rxn, respectively. The same results were obtained from the detection limit test in artificially inoculated pasteurized milk. The real-time PCR demonstrated the HSP 60 gene of H. pylori in 9 of 12 (75%) raw milk samples in different regions of Korea. These two rapid methods could be used to detect the presence of H. pylori in foods.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 5
• 1. 재료 5
• 2. 방법 10
• 2.1 균주 배양 10
• 2.2 Chromosomal DNA 추출 10
• 2.3 Real-time PCR primers와 probe 및 LAMP primers 제작 11
• 2.4 Conventional PCR 실시 14
• 2.5 Real-time PCR 실시 15
• 2.6 Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) 실시 15
• 2.7 primer 특이도 및 검출한계 16
• 2.8 식품 샘플의 준비 17
• Ⅲ. 결과 및 고찰 18
• 1. Real-time PCR 및 LAMP primer의 특이성 확인 18
• 2. rt-PCR과 LAMP의 검출 한계 비교 22
• 3. rt-PCR과 LAMP를 이용한 우유 샘플에서 H. pylori 검출 31
• 4. 식품 샘플 적용 34
• Ⅳ. 결론 39
• Ⅴ. 참고문헌 41
• Abstract 46