The study on dysregulated genes in polycystic kidney disease

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the renal diseases culminating in end-stage renal disease (ESRD). This disorder is caused by mutations of PKD1/2 or PKHD1, and it is typically characterized with cyst formation in the kidneys. Molecular hallmark of PKD is excessive accumulation of cyclic AMP (cAMP) and activation of ERK pathway. Renal tubular epithelial cells proliferate exceedingly, in turn, inducing cyst formation. As the disease progressed, inflammation and fibrosis occur and renal structure is destroyed at the end. Although PKD is the life-threatening disease, there is no authorized treatment so far. Thus, many researchers have tried to find out the new molecular targets for PKD treatment. In this dissertation, I tried to find the several genes related with PKD onset or progression.
In the previous study, it was revealed that receptor for advanced glycation end products (RAGE) and its ligands, S100A8/A9, were highly expressed in the kidneys of PKD mice and patients. Also, knockdown of RAGE reduced cyst growth in three dimensional (3D) culture system. Based on the previous data, I evaluated the effect of RAGE knockdown on cystogenesis in PKD mice. Adenovirus system was utilized to deliver shRage to PC2R mice, a PKD mouse model. It was observed that RAGE knockdown reduced cyst expansion and helped to renal function improvement. Slowed cystogenesis was attributed to less activation of ERK and NF-κB pathways. This study indicates that proliferation and inflammatory stimulus via RAGE activation aggravate cyst progression.
Although it is considered that renal epithelial defects mainly contribute to PKD development, cyst expansion affects adjacent renal tissues such as renal vasculatures. I found that semaphorin3C (SEMA3C) and its receptors were expressed higher in PKD epithelial cells compared with the normal renal epithelial cells. I hypothesized that increased SEMA3C could influence on human renal glomerular endothelial cell (HRGEC) under PKD progression. As a result, it was observed that treatment of recombinant SEMA3C protein inhibited angiogenesis of HRGEC via reducing the viability and the migratory ability. Experiments using SEMA3C mutant constructs showed that the effect of SEMA3C on HRGEC was dependent on C-terminal domain. Considering that upregulated SEMA3C caused rarefaction of the glomerular endothelial cells, detrimental feedback loop by SEMA3C accelerates renal function decline as PKD progresses.
Next, it was well-known that there are several causative genes accounting for PKD development besides PKD1/2 and PKHD1. One of the examples are genes which regulate primary cilia homeostasis. Thus, it is generally considered that PKD is one of the ciliopathies, diseases caused by ciliary defects. Primary cilia is microtubule-based organelles projecting from the plasma membrane. Primary cilia senses mechanical and chemical stimuli and is involved in cellular proliferation, polarity maintenance, and differentiation.
I tried to find the new gene involved in primary cilia homeostasis. From mRNA microarray using starved NIH/3T3 cells, calpain6 (capn6) was selected as a positive regulator for cilia formation and function. I discovered that capn6 expression was increased under ciliogenesis induction, and siRNA-based capn6 knockdown suppressed primary cilia formation. Furthermore, capn6 deficiency reduced the sensitivity to sonic hedgehog signal, one of the cilia-mediated pathways. Capn6 knockdown resulted in reduced α-tubulin acetylation, which might affect microtubule stability or activity of intraciliary proteins. Because capn6 does not contain acetylation-related domains, I hypothesized that capn6 influenced αTat1 and Hdac6, two major enzymes controlling tubulin acetylation level. However, capn6 deficiency did not change the expression levels of those enzymes, which indicates that capn6 will affect the function of these enzymes. This precise mechanism should be further investigated, and it is noteworthy to observe that capn6 depletion is accompanied by PKD development.
In conclusion, I excavated the novel genes as the potent therapeutic targets against PKD. I first discovered that these genes contributed to PKD aggravation, and I expect that this study will help to understand the confound mechanism on PKD.

국문 초록 (Abstract)

우성다낭신은 말기 신부전증을 유발하는 신장 질환 중 하나이다. 이 질환은 PKD1/2, PKHD1 유전자의 돌연변이에 의해 발병하며 신장에 낭포가 형성되는 특징이 있다. 다낭신의 분자생물학적 발병 기전은 과도한 cAMP의 축적과 ERK의 비정상적인 활성화로 알려져 있다. 이로 인해 신장관 상피 세포의 과도한 증식이 일어나며 결국엔 낭포 형성으로 이어진다. 질병이 진행될수록 염증과 섬유화 현상이 일어나며, 종국에는 정상 신장 조직이 파괴된다. 다낭신이 생명을 위협하는 심각한 질환임에도 불구하고 현재까지 치료제가 없으며, 많은 연구자들이 새로운 분자생물학적 치료 표적을 찾고자 노력하고 있다.
선행 연구에서 RAGE와 이 수용체의 리간드 중 하나인 S100A8/A9이 다낭신 동물 모델과 환자의 신장 조직에서 높게 발현함을 확인하였다. 또한 RAGE 발현 저하에 의해서 낭포의 크기가 감소한다는 것을 3D 세포 배양 조건에서 관찰하였다. 이러한 기존 결과를 바탕으로 RAGE의 발현 억제가 낭포 형성에 미치는 영향을 다낭신 마우스 모델에서 확인하고자 하였다. 이를 위하여 다낭신 동물 모델인 PC2R 마우스에 아데노 바이러스를 이용하여 RAGE shRNA를 주입하였다. 그 결과 RAGE 억제에 의해 낭포 증식이 감소하고 신기능이 호전됨을 확인하였다. 그리고 이러한 효과는 ERK와 NF-κB 활성 저해에 의한 것임을 알 수 있었다. 이를 통해서 RAGE 활성에 의한 세포 증식과 염증 반응이 다낭신 진행을 가속화 시킴을 확인하였다.
다낭신은 신장 상피 세포의 결함에 의해 발생하지만, 형성된 낭포는 신장 혈관 조직을 비롯한 신장내 주변 조직에 영향을 준다. 정상 신장 상피 세포와 비교하여 다낭신 상피 세포에서 SEMA3C와 그 수용체의 발현이 증가되어 있음을 관찰하였고, 다낭신의 악화 과정에서 SEMA3C가 신장 사구체 내피 세포에 영향을 줄 것이라고 예상하였다. 실험을 통해 SEMA3C 재조합 단백질 처리에 의해서 사구체 내피 세포의 혈관 형성 능력이 감소하는 것을 확인하였고, 이는 사구체 내피 세포의 생존과 이동성을 저해하기 때문이라는 것을 알 수 있었다. 또한 SEMA3C의 돌연변이 제작을 통해서 이러한 SEMA3C의 효과는 C말단부의 도메인에 의한 것임을 확인하였다. SEMA3C에 의한 사구체 내피세포의 소실이 관찰됨에 따라, SEMA3C가 다낭신을 악화시켜 신기능 저하를 유발하는 인자임을 알 수 있었다.
한편, 다낭신은 섬모 결함 질환으로도 알려져 있는데, PKD1/2, PKHD1 이외에 일차 섬모 조절 유전자에 문제가 생길 경우 발병한다. 일차 섬모는 microtubule로 이루어진 세포 소기관으로서, 외부의 물리/화학적 자극을 인식하며, 세포의 증식, 극성 유지, 분화 등에 관여한다.
다낭신 유발 인자로서 일차 섬모 항상성에 관여하는 새로운 유전자를 찾고자 하였다. 섬모 형성이 유도된 NIH/3T3 세포주에서 얻어진 mRNA로 마이크로어레이 분석을 진행하였고, capn6를 일차 섬모 조절 인자로 선택하였다. 섬모 형성 유도 조건에서 capn6의 발현이 증가함을 확인하였다. siRNA를 이용하여 capn6 발현을 저하시켰을 때 일차 섬모의 형성이 감소하고, 일차 섬모 매게 신호 중 하나인 sonic hedgehog 활성이 저하됨을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 capn6가 일차 섬모의 형성과 기능에 영향을 준다는 것을 확인하였다. 또한 capn6의 결핍이 α-tubulin의 아세틸화를 저해 시킨다는 것을 알 수 있었는데, α-tubulin의 아세틸화는 microtubule의 안정성과 섬모 관련 단백질의 활성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. capn6 단백질은 아세틸화와 관련 있는 도메인을 가지고 있지 않기 때문에 α-tubulin의 아세틸화에 관여하는 대표적인 효소인 αTat1, Hdac6에 간접적 영향을 줄 것이라고 예상하였다. 그러나 capn6의 발현 저하가 αTat1, Hdac6의 발현량 자체에 영향을 주지 않았다. 따라서 capn6가 이들 효소의 활성에 영향을 주는지 확인해야 하며, 궁극적으로 capn6 결함이 다낭신 발병과 관련이 있는지 관찰할 필요가 있다.
본 학위 논문에서는 다낭신 발병 및 악화 기작을 다각적으로 살펴보고자 하였으며, 이를 통해 다낭신의 치료 타겟 유전자를 새롭게 발굴하였다는 점에서 의의가 있다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Review of the literatures = 1
• 1.1. Overview of polycystic kidney disease = 2
• 1.1.1. Molecular and cellular features of polycystic kidney disease (PKD) = 2
• 1.1.2. PKD murine models = 7
• 1.1.3. Therapeutic targets against PKD = 9
• 1.2. Overview of vascular phenotype in polycystic kidney disease = 13
• 1.2.1. Angiogenesis in PKD = 13
• 1.2.2. Endothelial dysfunctions observed in PKD = 16
• 1.3. Overview of primary cilium = 18
• 1.3.1. Process of primary ciliogenesis = 18
• 1.3.2. Posttranslational modifications (PTMs) on microtubules: tubulin code = 23
• Ⅱ. Targeting of receptor for advanced glycation end products suppresses cyst growth in polycystic kidney disease = 26
• 2.1. Introduction = 27
• 2.2. Materials and Methods = 29
• 2.3. Results = 33
• 2.3.1. Effect of shRAGE adenovirus was validated in WT9-12 cells = 33
• 2.3.2. Reduction of RAGE by shRAGE adenovirus inhibited viability of WT9-12 cells = 35
• 2.3.3. PC2R mice exhibited severe PKD phenotype = 37
• 2.3.4. Rage expression was downregulated in shRage adenovirus-injected PC2R mice = 39
• 2.3.5. Suppression of Rage slowed cyst progression in PC2R mice = 41
• 2.3.6. Inhibition of Rage suppressed cyst formation originated from each tubule in PC2R mice = 44
• 2.3.7. Targeting to Rage lowered activation of signal molecules related with cystogenesis in PC2R mice = 46
• 2.4. Discussion = 48
• Ⅲ. Semaphorin3C affects renal glomerular endothelial cells in polycystic kidney disease = 50
• 3.1. Introduction = 51
• 3.2. Materials and Methods = 53
• 3.3. Results = 60
• 3.3.1. Semaphorin3C and its receptors were upregulated in PKD epithelial cells = 60
• 3.3.2. Semaphorin3C reduced viability of HRGEC = 62
• 3.3.3. Semaphorin3C inhibited angiogenesis of HRGEC = 65
• 3.3.4. SEMA3C mutant constructs were generated to investigate important region for SEMA3C function = 67
• 3.3.5. The effect of SEMA3C was diminished in absence of C-terminal domain = 70
• 3.3.6. PKD epithelial cells can influence glomerular endothelial cells via SEMA3C = 72
• 3.4. Discussion = 74
• Ⅳ. Deficiency of Calpain6 inhibits primary ciliogenesis = 76
• 4.1. Introduction = 77
• 4.2. Materials and Methods = 79
• 4.3. Results = 84
• 4.3.1. Primary cilia were induced in NIH/3T3 cells by serum starvation = 84
• 4.3.2. Putative positive regulators for ciliogenesis were screened by mRNA microarray in NIH/3T3 cells = 86
• 4.3.3. Candidate genes were selected and their expression levels were validated in vitro = 90
• 4.3.4. Deficiency of Calpain6 resulted in ciliogenesis defect = 92
• 4.3.5. Calpain6 knockdown caused decrease in level of acetylated α-tubulin at Lysine 40 = 94
• 4.4. Discussion = 96
• Ⅴ. CONCLUSION = 103