예쁜 꼬마 선충에 존재하는 tyrosylprotein sulfotransferase-A의 기능적 역할에 관한 연구 = Functional studies of tyrosylprotein sulfotransferase-A in Caenorhabditis elegans

국문 초록 (Abstract)

타이로신 O-황화기작(Tyrosine O-sulfation)은 모든 진핵생물에서 일어나는 막 단백질과 분비단백질의 수식화 과정(post-translational modification)중 하나이다. 타이로신-황(tyrosine sulfate)구조를 가지는 단백질들은 inflammation과 hemostasis에 관련된 것들과 subcellular matrix proteins이 있다. 타이로신 O-황화기작은 factors VIII 과 V의 coagulation, P-selectin glycoprotein ligand-1(PSGL-1), platelet glycoprotein Ibα, complement factor C4 그리고 hirudin 등이 생물학적 기능을 수행하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. C. elegans의 경우 tyrosylprotein sulfotransferase-A(TPST-A)를 클로닝 하여 동물세포에서 배양을 한 후 효소 활성 측정 연구가 진행된 바 있다. 하지만 C. elegans에서 TPST-A의 생물학적 기능 역할은 보고된 바가 없다.
본 연구자는 C. elegans에서 TPST-A의 기능적인 역할을 규명하기 위해서 먼저 TPST-A가 어느 부위에서 특이적으로 발현되는지를 알아보고, 또한 TPST-A에 의해서 황화작용이 일어나지 않으면 어떠한 영향이 미치는지를 밝힘으로써 이 효소의 생물학적 기능을 알고자 하였다. TPST-A의 프로모터로 예상되는 부위를 유전자 재조합 기법을 이용해서 GFP(green fluorescent protein) 벡터에 삽입하여 얻어진 constructs를 C. elegans의 생식선에 미세 주사하였다. fusion protein이 발현된 결과 다음 세대 C. elegans의 상피 세포(hypodermal cell)에서 특이적으로 발현된 것을 확인할 수 있었다. TPST-A의 기능을 일시적으로 억제시킬 수 있는 RNAi(RNA interference)기법을 사용한 결과 다음 세대 C. elegans의 유생단계 중 허물을 벗는 과정에서 이상이 생겼으며 이는 TPST-A가 표피(cuticle) 형성에 깊이 관여하고 있음을 나타낸다. C. elegans의 표피를 형성하는데 필요한 단백질 중에 하나인 콜라겐(collagen) 단백질을 암호화하는 유전자의 5가지 돌연 변이들에게 각각 TPST-A의 기능에 대한 RNAi를 시도한 결과 돌연 변이의 형태가 달라진 표현형을 보였다. 이 결과는 TPST-A가 표피형성에 직접적으로 또는 간접적으로 매우 중요한 역할을 하는 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Tyrosine O-sulfation is a kind of post-translation modification of membrane and secretory proteins that occurs in all eukaryotic organisms. Many proteins have been shown to contain tyrosine sulfate. Tyrosylprotein sulfotransferase (TPST-A) of Caenorhabditis elegans catalyzes the transfer of the sulfuryl group from 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) to tyrosine residue(s) within highly acidic motifs of polypeptides. Biochemical evidence indicates that the enzyme is a membrane-associated protein with a lumenally oriented active site localized in the trans-Golgi network. We obtained cDNA encoding Caenorhabditis elegans TPST-A from Dr. Yuji Kohara (National Institute of Genetics, Mishima, Japan).
To gain insights regarding the biological function of TPST-A, we used the reverse genetic tool, RNA interference (RNAi), to "knock out" enzyme in C. elegans. RNAi animals showed complex phenotypes similar to those described previously in mutations that are known to affect the cuticle, an extracellular matrix. In a typical experiment >70% of RNAi animals were affected by various phenotypes. Specific phenotypes similar to pull in worm's belt in random site on body (>10% of animals) and some worms were stationary and finally died in L2, L3, and L4 stages : affected animals were either completely paralyzed or moved only the anterior region, clearing a localized swath of Escherichia coli in the vicinity of the head and were shown striking defect, an inability to shed and degrade all of the old cuticle at each of the larval molts. Phenotypes also cause an arrest of growth usually at the molt from the third to the fourth larval stage (>40% of animals). Some adults are dumpy worms with retained many eggs and larvae and finally dead (>20% of animals). In addition, whereas wild-type animals showed a dark appearance, <5% of RNAi animals were translucent (compare wild-type). Also, we used TPST-A RNAi in rol-6(su1006 and e187) and sqt-1(sc1, sc13, and e1350) mutants. RNAi animals showed slightly short or dumpy phenotypes. These phenotypes indicate that TPST-A may catalyze tyrosine O-sulfation of a variety of protein substrates involved in diverse physiologic functions.

목차 (Table of Contents)

• 차례 = i
• 그림차례 = ⅲ
• 표 차례 = ⅳ
• 약어표 = ⅴ
• 국문요약 = ⅵ
• 제1장 서론 = 1
• 1. 타이로신 O-황화기작 (Tyrosine O-sulfation) = 1
• 2. 기존의 tyrosylprotein sulfotransferase(TPST)에 대한 연구 = 1
• 3. C. elegans에서 TPST에 대한 연구 = 3
• 4. C. elegans에서 발현되는 표피를 구성하는 콜라겐 유전자 = 4
• 5. C. elegans에서 예상되는 TPST-A의 역할 = 5
• 6. 연구 목적 = 6
• 제2장 실험재료 및 실험방법 = 7
• 1. 실험재료 = 7
• 1) 시약 = 7
• 2) 배지 = 7
• 3) C. elegans 균주 = 7
• 4) 미생물 균주 = 7
• 5) 효소 = 8
• 6) 부분 동정(Subcloning)에 사용된 벡터들 = 8
• 7) 기타 = 8
• 2. 실험 방법 = 8
• 1) NCBI 데이터 베이스 이용한 C. elegans TPST-A의 검색 = 8
• 2) TPST-A의 physical 및 genetic map = 9
• 3) GFP 발현을 위한 부분동정 = 9
• 4) RNAi (interference)를 위한 dsRNA(double strand RNA)제조 = 10
• (1) in vivo excision = 10
• (2) 시험관 전사 (in vitro transciption) = 10
• 5) TPST-A의 RNAi = 13
• 6) 미세 주입 = 13
• 7) Green fluorescence protein(GFP)의 발현 관찰 = 14
• 8) sqt-1과 rol-6 돌연변이형에 대한 RNAi = 14
• 제3장 결과 = 15
• 1. 꼬마 선충과 인간의 TPST 유사 아미노산 서열 검색 = 15
• 2. 꼬마 선충의 TPST-A 유전자의 구조와 염색체내의 위치 = 15
• 3. 꼬마 선충에서 TPST-A의 발현 양상 관찰 = 17
• 4. RNAi (interference)를 통한 TPST-A의 기능 연구 = 17
• 1) RNAi 표현형과 야생형과의 운동성 관찰 = 17
• 2) RNAi 표현형들의 시간대별 관찰 = 17
• 3) RNAi의 주된 표현형 이외에 다른 표현형 = 21
• 5. 표피를 구성하는 콜라겐 단백질의 돌연변이형인 sqt-1(sc1)Ⅱ, sqt-1(sc13)Ⅱ, sqt-1(e1350)Ⅱ, rol-6(su1006)Ⅲ, rol-6(e187)Ⅲ 에 대한 RNAi = 26
• 제4장 고찰 = 36
• 제5장 결론 = 40
• 참고문헌 = 41
• 영문요약 = 51