영구화된 정상 및 Nrf2가 저해된 일차 각질 피부 세포주 제작 및 이를 활용한 동물실험 대체 독성 연구

국문 초록 (Abstract)

피부는 다양한 외부 물질로부터 신체의 물리적 및 화학적 보호에 주요한 역할을 한다. 동물 실험은 피부의 방어 기능을 연구하기 위해 자주 사용되어 왔다. 그러나, 동물 실험과 관련된 몇 가지 사회적 및 윤리적 문제로 인해 in vitro 모델의 대안 개발이 지속적으로 제기되고 있다. 피부 연구를 위한 신뢰할 수 있는 in vitro 모델 시스템을 구축하기 위해 HPV의 두 종양 단백질 E6과 E7을 과발현시키기 위해 레트로 바이러스 형질 도입을 사용하여 영구화된 인간 포피 각질 세포 (iHFK)를 만들었다. 피부 세포에 대한 표지 단백질 인 keratin 14의 발현, HPV E6 / E7 유전자의 숙주 게놈 DNA 로의 integration 및 p53과 pRb의 감소 된 수준을 성공적으로 확인했다. 다음으로, retinoic acid, hydroquinone 및 formaldehyde와 같은 여러 화합물에 대한 iHFK 및 HaCaT 세포의 유사한 반응성을 발견했다. 나는 3D organic raft culture를 성공적으로 수립함으로써 iHFK의 효율적인 차별화 능력을 확인했다.
피부 방어 시스템에서 ROS의 해독은 피부의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. Heme oxygenase 1 (HO-1), peroxiredoxins 1 및 6, NAPD (H) dehydrogenase, quinone 1 (NQO1) 및 glutathione biosynthesis enzymes glutamate-cysteine ligase (조절 및 촉매 서브 유닛) 및 glutathione synthetase와 같은 다양한 세포 보호 단백질은 기본 leucine zipper transcription factors의 cap'n'collar 계열의 구성원 인 nuclear factor erythroid 2-like 2 (Nrf2)에 의해 조절되는 것으로 나타났다. 따라서, 나는 lentiviral shRNA 발현 시스템을 사용하여 HaCaT 및 iHFK 세포에서 Nrf2 단백질을 파괴하여 피부 질환의 상태를 모방 한 피부 세포주를 만들었다. Nrf2가 결핍 된 HaCaT 및 iHFK 세포주는 Nrf2 mRNA와 단백질의 수준이 감소 함을 발견했다. 또한, Nrf2가 결핍 된 HaCaT 및 iHFK 세포주는 Nrf2 down-stream 표적 유전자 인 NQO1 및 HO-1 mRNA와 단백질의 발현 정도가 줄어드는 것을 발견했다. 나는 또한 Nrf2가 결핍 된 HaCaT와 iHFK 세포가 세포 독성에 더 민감하다는 것을 관찰했다. 마지막으로, 안정한 Nrf2가 결핍 된 HaCaT 및 iHFK 세포가 ROS에 감수성이 증가한다는 사실이 항산화 Nrf2 경로를 활성화 할 수 없다는 것을 발견했다.
결론적으로, 정상 및 Nrf2가 결핍 된 HaCaT 및 iHFK 세포를 성공적으로 수립하고 특성화했다. 또한 몇 가지 독성 화합물에 대한 반응의 유사점과 차이점을 확인했다. 나는 이들 새로 확립 된 정상 및 Nrf2가 결핍 된 HaCaT 및 iHFK 세포가 화장품 후보 화합물의 잠재적 인 독성을 예측하고 그 독성 학적 작용 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구가 되기를 바란다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Skin plays a primary role in physical and chemical protection of our body from a variety of external materials. Animal testing has been frequently employed to study this defense function of skin. However, due to several social and ethical issues associated with animal testing, need for development of alternative in vitro models has been consistently raised. In order to establish reliable in vitro model system to study skin, I generated immortalized human foreskin keratinocytes (iHFKs) by using retroviral transduction to overexpress two oncogenic proteins, E6 and E7 from HPV. I successfully confirmed expression of keratin 14, a marker protein for keratinocytes, integration of HPV E6/E7 genes into host genomic DNAs, and the reduced levels of p53 and pRb. Subsequently, I found similar responsiveness of iHFKs and HaCaT cells to several compounds such as retinoic acid, hydroquinone, and formaldehyde. I confirmed the efficient differentiation capability of iHFKs through a successful establishment of three-dimensional organic raft cultures.
In skin defense system, detoxification of ROS has a significant role in homeostasis of skin. Various cytoprotective proteins, such as heme oxygenase1 (HO-1), peroxiredoxins 1 and 6, NAPD (H) dehydrogenase, quinone 1 (NQO1), and the glutathione biosynthesis enzymes glutamate-cysteine ligase (regulatory and catalytic subunits) and glutathione synthetase have been shown to be regulated by nuclear factor erythroid 2-like 2 (Nrf2), which is a member of the cap’n’collar family of basic leucine zipper transcription factors. Thus, I knocked-down Nrf2 protein in HaCaT and iHFK cells by using a lentiviral shRNA expression system to establish keratinocyte cell lines which mimic states of skin diseases. I found that Nrf2-deficient HaCaT and iHFK cell lines express reduced levels of Nrf2 mRNA and protein. In addition, I found that Nrf2-deficient HaCaT and iHFK cell lines express reduced levels of Nrf2 downstream target genes, NQO1 and HO-1 mRNA and protein. I also observed that Nrf2-deficient HaCaT and iHFK cells are more susceptible to cytotoxicity. Finally, I found that this increased susceptibility of stable Nrf2-deficient HaCaT and iHFK cells to ROS is due to an inability to activate the anti-oxidative Nrf2 pathway.
In conclusion, I successfully established and characterized normal and Nrf2-deficient HaCaT and iHFK cells. I also confirmed similarities and differences in their responsiveness to several toxic compounds. I hope these newly established normal and Nrf2-deficient HaCaT and iHFK cells will be a valuable tool to predict the potential toxicity of cosmetic candidate compounds and study their toxicological mechanism of action.

목차 (Table of Contents)

• LIST OF CONTENTS
• ABSTRACT i
• Introduction 1
• Materials and Methods 15
• Isolation of primary HFKs 15
• Cell culture and reagent 16
• Immortalization of primary HFKs and Nrf2 knock-out 17
• PCR analysis 18
• Western blot analysis 19
• RNA extraction and quantitative real-time RT-PCR 20
• Cytotoxicity assay (MTT) 21
• Differentiation of iHFKs 22
• 3D skin culture without a dermal equivalent 22
• 3D skin cultures with a dermal equivalent 23
• Immunohistochemistry 24
• Histological analysis (H&E staining) 25
• ROS measurement 25
• Statistical analysis 26
• Abbreviations 27
• Results 28
• Isolation of primary HFKs from patients’ foreskins 28
• Immortalization of primary HFKs by using an HPV16-E6E7-encoding retrovirus 30
• Confirmation of keratinocyte marker and HPV16 E6E7 proteins expression in iHFKs 35
• Characterization of responsiveness of iHFKs to exogenous stimuli 38
• Application of iHFKs to cytotoxicity assessment 41
• Differentiation of iHFKs 45
• Construction of 3D skin cultures by using iHFKs 50
• Establishment of Nrf2-deficient HaCaT and iHFK cell lines by a lentiviral transduction 57
• Nrf2-deficient HaCaT and iHFK cell lines express reduced levels of Nrf2 mRNA and protein 61
• HaCaT-shNrf2#2 and iHFK-shNrf2#2 cells express reduced levels of NQO1 and HO-1 mRNA and protein 65
• Nrf2-deficient HaCaT and iHFK cells are more susceptible to cytotoxicity 70
• Increased susceptibility of stable Nrf2-deficient HaCaT and iHFK cells to ROS is due to an inability to activate the anti-oxidative Nrf2 pathway 75
• Discussion 79
• Reference 91
• 국문 초록 99