Induction of Apoptosis by Protein Kinase Inhibitors in the Prostate and Breast Cancer Cell Lines : 전립선암과 유방암세포주에서 protein kinase 억제제에 의한 apoptosis의 유도

국문 초록 (Abstract)

Apoptosis는 배발생과 성장, 분화과정에서 주된 조절적 기작으로서 제공되는 생리학적 세포사의 기작중의 하나이다. 전통적인 PKC의 활성은 세포의 성장, 분화 그리고 유전자 발현과 같은 세포의 다양한 기능을 이끌어내는 신호전달 과정의 단계적 반응에서 가장 초기 과정중의 하나이다. 그리고 apoptosis는 항암화학치료와 방사선 치료시 나타나는 암세포사의 하나이다. 그러므로 우리는 항종양성인자에 속하는 RA와 protein kinase 억제제로 사용되는 H-7과 HA1004를 전립선 암세포와 유방암세포에 처리하였을 때 apoptosis를 유발할 수 있는지를 조사하였다. 전립선암과 유방암세포에서 PKC신호 전달과정의 개요는 억제제인 H-7와 PKC의 활성제인 TPA에 의해 조사되었다. 그리고 PKC 동위효소에 의한 특징은 western blot에 의해 확인되었다. 배양된 전립선암 세포와 유방암 세포에서는 H-7, HA1004, 그리고 RA의 처리에 의해 dose에 의존적인 방법으로 apoptosis를 일으켰다. 그러나, PMA는 전립선암세포에서는 H-7에 의해 유도된 apoptosis와 RA에 의해 유도된 apoptosis가 부분적으로나 일시적으로 억제되었으나, 유방암세포에서는 RA에 의해 유도된 apoptosis에는 억제하지 않았다. 그러므로 우리는 RA가 처리되었을 때 apoptosis는 간접적으로 전립선암세포에서 PKC와의 어떤 연관성을 제안할 수 있었다.
PKC의 억제제와 활성제 각각에 대한 다른 반응들은 많은 다른 PKC의 isozyme와 연관되어 있다. 그러므로 우리는 이들의 isozyme들이 이전에 apoptosis를 유발한 농도로 처리했을 때 어떻게 변화 되어지는지를 관찰하여 apoptosis와 PKC signaling 과정에서 중요한 isozyme의 관련성을 알아보고자 하였다. 그 결과 PKCα는 고려할만한 발현의 변화를 나타내었지만 같은 classic PKC isozyme에 속하는 PKCβ와 γ는 그 발현을 찾아 볼 수 조차 없었다. 그런데 반해 다른 PKC의 그룹에 속하는 PKC δ, ε, ζ, λ와 μ는 많은 발현의 변화를 보여 주었으며 특히 많은 문헌에서 apoptosis에 관여 하는 것으로 알려진 PKCδ와 ε에서 많은 변화를 보여주었다.
이상의 결과로서, 우리는 H-7, HA1004, 그리고 RA가 사람의 전립선 암세포와 유방암 세포주에서 적절한 농도에서 apoptosis를 유발하며, 이렇게 유발된 apoptosis는 PKC의 isozyme에 의해 직접 또는 간접으로 조절되어진다는 것을 알 수 있었다. 특히 이들 isozyme 들중에서도 calcium에 독립적으로 조절되는 것들과 atypical isozymes이 더 많이 작용할 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Apoptosis is one of the key mechanisms of physiological cell death as a major controlling mechanisms in the embryo developments, growth, and differentiation. Apoptosis is accompanied by the formation of apoptotic bodies and DNA ladder. The activation of protein kinase C (PKC) is one of the earliest event in the cascades of signal transduction pathway inducing a various cellular functions such as cell growth, differentiation, and gene expression. Apoptosis is induced by chemotherapy and inonizing radiation therapy of cancer cell.
In this study, it was examined whether human prostate cell (PC-3 and DU145), and human breast cancer cell (MCF-7, MDA-MB-231, MCF/DOX), undergo apoptosis by treatment with the protein kinase inhibitors, H-7 and HA1004, and antineoplastic reagent, RA, and a tumor promoting factor, PMA. Apoptosis of these cells were dose-dependently induced by treatment with H-7, HA1004, or RA. PMA inhibited apoptosis of cells treated with H-7 or HA1004, whereas it didn't inhibit apoptosis of cells treated with RA.
It has been known that the various responses of inhibitor and activator of PKC were related with a diverse isozymes of PKC. Therefore, PKC isozymes during the apoptosis of these cells in the presence of PKC activator and inhibitor were examined by using Western blot. The amount of PKCβ and γ, classic PKC isozyme family, couldn't be detected. The amount of PKCα appeared a little altered. On the other hand, PKCδ, ε, ζ, λ(ι), and μ, calcium-independent PKC family, appeared changed in their amounts. Pattern of PKCδ, ε, and ζwere consistent with the results reported previously elsewhere.
In sum, the apoptosis of human prostate cancer cell and breast cancer cell lines was induced when treated with appropriate concentration of H-7, HA1004, and RA. These results suggest that the induction of apoptosis may be directly and/or indirectly regulated by PKC isozymes. It appears that the apoptosis in prostate and breast cell lines is related especially with calcium-independent isozymes and atypical isozymes rather than other PKC isozymes.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• List of Tables = ⅱ
• List of Figures = ⅲ
• Abbreviation = ⅴ
• Abstract = 1
• Ⅰ. Introduction = 3
• Ⅱ. Materials and Methods
• 1. Materials = 25
• 2. Cell culture = 25
• 3. MTT assay = 26
• 4. Fluorescence microscope = 27
• 5. Semithin structure = 27
• 6. Western blotting = 28
• Ⅲ. Results
• Mtt assay for cytotoxicity = 30
• Apoptotic morphological change by Hoechest 33258 = 33
• Apoptotic morphological change by AO and EtBr = 34
• Analysis of PKC isozymes by western blot = 36
• Ⅳ. Disscusion = 89
• Ⅴ. References = 99
• Ⅵ. Abstract in Korean = 153