Decoding human regulatory T cell programs from disease to development in the thymus = 질병에서 흉선 발달까지의 인간 조절 T세포 프로그램 규명

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Regulatory T cells (Tregs) serve as the essential guardians of immune homeostasis, maintaining tolerance to self while restraining excessive inflammation and autoimmune responses. Since their first discovery only 30 years ago, extensive research has been conducted in understanding their role in health and disease. The heterogenous function of Tregs across different tissues and diseases has been shown to be profoundly context-dependent. Treg instability or insufficiency has been shown to contribute to autoimmune disease and inflammatory disorders. Yet on the other hand, they can exhibit heightened functionality across various cancers, suppressing an effective anti-tumor immune response. This dual nature underscores a central theme in understanding immune regulation, illustrating how the same cellular lineage can adopt such divergent functionalities across immune contexts. This thesis aims to understand this duality by dissecting Treg function in autoimmune disease and cancer. I then seek to address how Treg functionality and stability are conferred during Treg development in the human thymus and aim to elucidate the gene regulatory networks and transcription factors that drive Treg development.

In the first part of my thesis, I interrogate the role of Tregs in the autoimmune disease, psoriasis. Through integrated mass cytometry, single-cell RNA sequencing and in-vitro¬ validation, I uncover an impaired Treg trafficking phenotype in the peripheral blood of psoriasis patients, potentially preventing sufficient Treg-mediated suppression of the inflamed, psoriatic skin.

In the second part of my thesis, I profile and compare circulating immune dynamics in head and neck squamous cell carcinoma patients that have undergone neoadjuvant immune checkpoint blockade therapy. I uncover systemic activation of effector T cells and highly activated and suppressive regulatory T cells from patients that have undergone combination anti-PD-L1 + anti-CTLA-4 therapy, helping to explain clinical and therapeutic responses.

These findings raised deeper mechanistic questions as to how Treg function is conferred and stabilized and how it can become perturbed. To answer this, I go back to the origins of regulatory T cells where they first develop in the thymus. In the final part of my thesis, I sought to understand the mechanisms that establish and maintain Treg function and stability during lineage commitment and differentiation in the human thymus. By constructing a single-cell multiome human thymus atlas, I uncover the dynamic gene regulatory networks that underlie Treg development in the thymus and develop a framework from which we can understand this lineage-specific regulation. I identify putative transcription factors that drive Treg differentiation and regulate FOXP3 expression. I validate several of these driver-transcription factors utilizing a CRISPR-Cas9-mediated knockout system of primary human thymocytes to demonstrate that loss of these core regulators impairs thymic Treg differentiation.

Together these findings uncover the underlying developmental gene regulatory mechanisms that establish thymic regulatory T cell function and stability and can serve as a valuable resource for the development of stable Treg-based therapies.

국문 초록 (Abstract)

조절 T 세포(Regulatory T cells, Tregs)는 면역 항상성의 핵심 조절자로서 자가에 대한 면역관용을 유지하고 과도한 염증 및 자가면역 반응을 억제하는 역할을 한다. Tregs가 처음 발견된 지 약 30년밖에 지나지 않았지만, 다양한 질환에서 그 기능적 역할을 규명하기 위한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 그러나 Treg의 기능은 질병의 종류와 환경에 따라 현저히 다르게 나타난다. Treg의 불안정성 또는 결핍은 자가면역 및 염증성 질환의 발병에 기여하는 반면, 여러 종류의 암에서는 과도하게 안정적이고 강한 억제 기능을 보임으로써 효과적인 항종양 면역 반응을 방해한다. 이러한 이중적 특성은 동일한 세포 계통이 면역 환경에 따라 상반된 기능적 결과를 보일 수 있음을 보여주며, 면역 조절 기전을 이해하는 데 있어 중요한 주제를 이룬다. 본 논문은 이러한 Treg의 이중성을 자가면역질환과 암의 맥락에서 규명하고, 더 나아가 Treg의 기능성과 안정성이 인간 흉선 발달 과정에서 어떻게 부여되는지를 추적함으로써 그 발생학적 기원을 밝히고자 한다.

논문의 첫 번째 부분에서는 자가면역질환인 건선에서의 조절 T 세포기능을 규명하였다. Mass cytometry, 단일세포 전사체 분석(single-cell RNA sequencing), 및 in-vitro 검증을 통합적으로 수행한 결과, 건선 환자의 말초혈액에서 Treg의 이동 능력이 손상된 표현형을 확인하였다. 이는 염증이 지속되는 건선 병변 부위로 충분한 조절 T 세포가 이동하지 못함으로써 면역 억제가 적절히 이루어지지 못하는 기전을 제시한다.

두 번째 부분에서는 수술 전 면역관문억제제 치료를 받은 두경부 편평세포암 환자를 대상으로 순환 면역 세포의 변화를 분석하였다. 단일세포 수준의 면역 세포 분석을 통해, anti-PD-L1과 anti-CTLA-4 병합 치료를 받은 환자에서 효과기 T 세포의 전신적 활성화와 함께 고도로 활성화되고 강력한 억제 기능을 지닌 Treg의 확장을 확인하였다. 이러한 결과는 면역항암치료 후 환자 예후의 차이를 설명하는 분자적 근거를 제공한다.

이러한 질병 기반 연구 결과는 조절 T 세포 기능이 근본적으로 어떻게 조절되고 변형되는가에 대한 보다 근원적인 질문을 제기하였다. 이에 본 논문의 마지막 부분에서는 조절 T 세포가 최초로 분화하는 인간 흉선에서 그 발생학적 조절 기전을 규명하고자 하였다. 단일세포 전사체 및 염색질 접근성 (chromatin accessibility)데이터를 통합 분석하여 흉선 내 Treg 분화 과정에서 작동하는 동적 유전자 조절 네트워크를 재구성하고, 계통 특이적 조절을 설명할 수 있는 분석 체계를 확립하였다. 이 과정을 통해 FOXP3 발현과 조절 T 세포 분화를 유도하는 주요 전사인자들을 규명하였으며, 인간 흉선세포에서 CRISPR–Cas9 기반의 유전자 결손 실험을 수행하여 이들 전사인자의 결손이 흉선 조절 T 세포 분화를 저해함을 실험적으로 입증하였다.

종합하면, 본 연구는 흉선 내에서 조절 T 세포의 기능성과 안정성을 결정하는 발달적 유전자 조절 기전을 규명하였으며, 이러한 통합적 분석 결과는 향후 안정적 조절 T 세포기반 면역치료 전략의 개발에 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of Contents iv
• Acknowledgements vii
• Abbreviations x
• Chapter 1 1
• Introduction
• 1.1 A brief history of regulatory T cells 1
• 1.2. Mechanisms of suppression by regulatory T cells 3
• 1.3. Development of regulatory T cells 5
• 1.4. Epigenetic regulation of Treg development and stability 9
• 1.5. Treg plasticity 11
• 1.6. The dual nature of regulatory T cells in disease 12
• Chapter 2 14
• Impaired regulatory T cell trafficking in psoriasis
• 2.1 Introduction 14
• 2.2 Results 16
• 2.2.1 Characterization of circulating immune cells 16
• 2.2.2 Meta-cluster analysis of psoriatic and healthy Tregs 18
• 2.2.3 Supervised analysis of Treg chemokine receptors and functional markers 21
• 2.2.4 Severity of psoriasis relates to dynamics in Treg chemokine receptor and functional marker expression 25
• 2.2.5 Single-cell RNA sequencing of Tregs in the lesional psoriatic skin 27
• 2.3 Discussion 29
• 2.4 Materials and Methods 32
• 2.5 Supplementary Materials 40
• 2.5.1 Supplementary Tables 40
• 2.5.2 Supplementary Figures 41
• Chapter 3 43
• Enhanced Treg function following combination immunotherapy in resectable head and neck squamous cell carcinoma
• 3.1 Introduction 44
• 3.2 Results 46
• 3.2.1 Changes in the broad immune landscape induced by monotherapy and combination ICB 46
• 3.2.2 Meta-clustering of the T cell compartments 50
• 3.2.3 Systemic immune dynamics in relation to patient treatment outcomes 56
• 2.3 Discussion 61
• 2.4 Materials and Methods 62
• Chapter 4 69
• Unraveling gene regulatory networks and driver TFs of regulatory T cell development in the thymus
• 4.1 Introduction 70
• 4.2 Results 72
• 4.2.1 Integration and annotation of cell types 72
• 4.2.2 Gene regulatory analysis of Tregs 75
• 4.2.3 GRN triplet scoring 81
• 4.2.4 Pseudotime analysis and identification of putative driver TFs 85
• 4.2.5 Granger causality inference from TF to gene links 92
• 4.2.6 Optimization of an in-vitro CRISPR gene KO assay of human thymocytes 95
• 4.2.7 In-vitro CRISPR KO of putative driver TFs in Treg differentiation from human thymocytes 100
• 4.3 Discussion 103
• 4.4 Materials and Methods 107
• 4.5 Supplementary Materials 110
• 4.5.1 Supplementary Figures 110
• Chapter 5 111
• Conclusion
• References 114
• 국문 초록 136