Functional production of soluble recombinant shark antibody through chaperone co-expression = 상어 항체의 가용성 재조합 단백질 발현에 관한 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Since albumin increases the half-life in the body through FcRn-mediated recycling, albumin or anti-albumin antibody is fused to target drug, which is used for half-life extension purposes. Shark antibodies composed of only heavy chains have the smallest antigen-binding domain, the variable new antigen receptor (VNAR), in vertebrates. Anti-albumin VNAR is known to be insoluble in E. coli expression systems. In this study, I aimed to improve recombinant anti-albumin VNAR expression in E. coli by combining various chaperone system and culture conditions. After co-expression with NAC/RAC and TRiC, soluble expression of anti-albumin VNAR was improved by about 28% when protein expression was induced at low temperature. However, protein aggregation was observed during purification of recombinant anti-albumin VNAR, which may indicate that the protein was not folded correctly. After co-expression with PDI in E. coli with an oxidized cytoplasmic environment, soluble expression was improved by 54% when anti-albumin VNAR was induced at low temperature. By purification, high purity recombinant anti-albumin VNAR was obtained in soluble form. In addition, to investigate whether the protein expression system constructed in E. coli can be applied to other proteins expressed insoluble, VEGF with nine disulfide bonds was used. As a result, soluble VEGF expression and purification were confirmed. In conclusion, the protein expression system of E. coli was optimized for soluble expression of anti-albumin VNAR. Furthermore, recombinant anti-albumin VNAR can be used for the development of therapeutics by fusion with the target material for half-extension, and the protein expression optimization system constructed in this study is expected to be significantly improved if applied to various insoluble proteins.

국문 초록 (Abstract)

알부민은 FcRn-mediated recycling을 통해 체내 반감기가 증가되기 때문에, 타겟 약물에 알부민이나 알부민항체를 융합하여 반감기 연장 목적으로 많이 이용된다. 상어의 항체는 heavy chain으로만 구성되어 있고, 척추동물계에서 가장 작은 항원-결합 부위를 가지고 있으며 이 부위를 Variable New Antigen Receptor (VNAR)라고 명명하고 있다. 대장균에서 재조합 anti-albumin VNAR 단백질은 일반적으로 insoluble하게 발현된다고 알려져 있다. 본 연구에서는 다양한 샤페론 및 발현 조건을 조합하여 대장균에서 재조합 anti-albumin VNAR 단백질의 발현을 개선시키고자 하였다. NAC/RAC와 TRiC를 함께 발현시키고 저온 조건에서 발현을 유도하였을 때 anti-albumin의 가용성 발현이 약 28% 정도 개선되었다. 하지만, 정제과정을 진행하였을 때 단백질 침전이 나타났고 이것은 단백질의 정확한 폴딩이 이루어지지 않았기 때문임을 예측할 수 있었다. 산화된 세포질 환경을 가지는 대장균에서 PDI와 함께 저온 조건에서 발현을 유도하였을 때 anti-albumin VNAR의 가용성 발현이 54%정도 향상되었고, 정제를 진행하였을 때 고순도의 anti-albumin VNAR 단백질을 얻을 수 있었다. 정제한 anti-albumin VNAR과 human serum albumin과의 결합력을 ITC를 이용하여 확인하였다. 또한 대장균에서 구축한 단백질 발현 시스템을 insoluble하게 발현되는 다른 단백질에도 적용할 수 있는지를 조사하기 위해 9개의 disulfide bond를 가지고 있는 VEGF로 검증하였을 때 soluble VEGF 발현을 확인하였고, 활성 형태의 VEGF를 순수분리 하였다. 종합적으로 anti-albumin VNAR을 soluble하게 발현시키기 위해 대장균의 단백질 발현 시스템을 최적화하였다. anti-albumin VNAR은 반감기 연장이 필요한 타겟 물질과 융합하여 다양한 질병 치료제 개발에 이용될 수 있고, 본 연구에서 구축한 단백질 발현 시스템을 적용하여 단백질 발현으로 어려움이 있는 다양한 단백질에 적용한다면 단백질 의약품 치료제 개발에 기여할 수 있을 것이라 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• ABBREVIATIONS
• ABSTRACT
• INTRODUCTION
• MATERIALS AND METHODS
• 1. Materials
• 2. Cloning and Plasmid construct
• 3. Strains and culture conditions: transformation, media, culture and induction
• 4. Protein expression and purification: small scale test, large scale purification, quantitative analysis
• 5. SDS-PAGE and western bolt analysis
• 6. The binding affinity assay using isothermal titration calorimetry (ITC)
• 7. VEGF activity assay
• RESULTS
• 1. Recombinant anti-albumin VNAR was expressed as the insoluble form in E. coli
• 2. Soluble expression of anti-albumin VNAR is increased with co-expression of chaperone system
• 3. The co-expression of recombinant anti-albumin VNAR with PDI was expressed as soluble form in oxidized cytoplasm of E. coli
• 4. The binding affinity between human serum albumin and anti-albumin VNAR
• 5. The expression and purification of recombinant VEGF under optimal condition
• DISCUSSION
• REFERENCES
• ABSTRACT IN KOREAN
• ACKNOWLEDGEMENTS