Roles of Folic Acid in Skeletal Muscle Cell Development = 근세포 발달에 있어서 엽산의 역할

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Folic acid is a water-soluble vitamin in the B-complex group, and exogenous intake is required for health, growth and development. As a precursor of cofactors, folic acid is required for one-carbon donors in the synthesis of DNA bases and other essential biomolecules. A lack of dietary folic acid can lead to folic acid deficiency and can therefore result in several health problems, including macrocytic anemia, elevated plasma homocysteine, cardiovascular disease, birth defects, carcinogenesis, muscle weakness, and difficulty walking. Previous studies implied that folic acid might exert a positive effect on skeletal muscle functions. However, the precise roles of folic acid in skeletal muscle differentiation are still poorly understood. In this study, the role of folic acid was investigated by using C2C12 myoblast cells. First, folic acid supplementation to C2C12 cells resulted in increase of formation of multinucleated myotubes, the fusion index, and creatine kinase activity in a concentration-dependent manner. In addition, Western blot analyses revealed that expressions of muscle-specific marker MyHC as well as myogenic regulatory factors, MyoD and myogenin, were increased in folic acid-treated myotubes during myogenic differentiation. Folic acid supplementation stimulated the Akt pathway and this was inhibited by LY294002 in C2C12 cells. This result revealed that Akt was required in mediating the stimulating effect of folic acid supplementation on muscle cell differentiation and fusion. These results indicate that folic acid supplementation stimulates differentiation of C2C12 cells through activation of Akt. Second, the effect of folic acid deficiency on myogenesis in skeletal muscle cells was studied and found that folic acid deficiency induced proliferation inhibition and cell cycle breaking as well as cellular senescence in C2C12 myoblasts, implying that folic acid deficiency influences skeletal muscle development. Folic acid deficiency also inhibited differentiation of C2C12 myoblasts and induced deregulation of the cell cycle exit and many cell cycle regulatory genes. Folic acid deficiency inhibited expression of muscle-specific marker MyHC as well as myogenic regulatory factor (myogenin). Moreover, immunocytochemistry and Western blot analyses revealed that DNA damage was more increased in folic acid-deficient medium-treated differentiating C2C12 cells. Furthermore, folic acid resupplementation reversed the effect on the cell cycle and senescence in folic acid-deficient C2C12 myoblasts but did not reverse the differentiation of C2C12 cells. Altogether, these results suggest that folic acid is necessary for normal development of skeletal muscle cells.

국문 초록 (Abstract)

엽산(folic acid)은 비타민B군에 해당하는 수용성 비타민으로서 DNA 합성에 영향을 미치어 세포의 분열과 성장에 중요한 역할을 한다. 엽산은 근육의 기능과 연관이 있다는 보고가 있지만 이와 관련하여 정확한 분자기전과 근육세포 발달 과정에서의 역할에 대해서는 아직 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 엽산이 근육세포의 성장과 분화에 기여하는지와 엽산의 결핍이 근세포 발달에 미치는 영향을 살펴보았다. 첫번째로 생쥐 유래 근육모세포주인 C2C12 세포에 엽산을 처리하여 근육세포의 분화에 상승효과를 나타내는지 조사하였다. 연구 결과, 엽산을 C2C12 세포에 처리하였을 때 농도 의존적으로 근관세포(myotube)의 형성이 증가하였으며, 분화지표로 알려진 크레아틴키나아제(creatine kinase) 활성과 분화 표지인자인 MyoD, myogenin 및 MyHC의 단백질 발현이 대조군에 비하여 증가하였다. 또한 면역형광염색을 통하여 분화된 근관세포의 세포융합지수를 확인한 결과, 엽산의 농도별 처리에 따른 세포융합지수가 증가하였다. 엽산의 근육 형성에 관하여 어떠한 신호전달경로를 통하여 조절되는지를 확인한 연구에서는 Akt/mTOR 신호전달 체계를 통하여 4E-BP1과 p70S6K의 활성을 증가시킴으로서 근세포의 분화를 유도한다는 것을 확인하였다. 따라서 Akt의 저해제인 LY294002를 엽산과 함께 처리한 결과 LY294002가 Akt의 인산화를 억제하였으며, 그에 따라 MyoD, myogenin 및 MyHC의 발현이 감소시킨다는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 엽산은 Akt 세포신호전달 경로를 통하여 C2C12의 세포분화를 유도한다는 것을 확인할 수 있었다. 두번째 연구에서는 엽산의 결핍이 근육 발달에 미치는 영향에 대해 조사한 결과, 세포 성장의 억제, 세포주기 장애, 세포의 노화 유도 및 근세포의 분화 억제가 나타났다. 엽산의 결핍에 따른 근세포 분화 억제에 대해 살펴보기 위하여 분화와 관련된 DNA 손상, 세포주기, 세포주기와 관련된 유전자 변화에 대해 살펴보았다. 연구 결과, 엽산의 결핍에 따라 DNA 손상, sub-G1의 증가 및 세포주기와 관련된 유전자의 조절 이상이 나타났다. 더 나아가 엽산이 결핍된 상태에서 엽산를 재보충하였을 때의 효과를 실험한 결과, 근육 세포의 성장에 있어서 엽산의 재보충은 세포의 재성장 및 정상적인 세포 주기를 보여주었으며, 또한 노화세포의 수가 더 이상 증가하지 않았다. 하지만 근세포의 분화 측면에서 엽산의 재보충은 엽산 결핍에 따른 분화 억제 효과를 막지는 못하였다. 위 결과를 종합해 볼 때 엽산은 정상적인 근육 발달에 중요한 영양성분임을 시사한다.