호기성 Bacillus subtilis-SB1 와 혐기성 Clostridium butyricum-SB2의 probiotic 특성에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

본 실험은 가축의 병원성 세균에 대해 항균력을 가지는 Bacillus spp.를 분리, 동정하여 배양원가 절감을 위한 고체발효공정을 확립하고 Clostridium butyricum SB-2의 대량 액상 배양법의 구축하며 B. subtilis SB-1와 C. butyricum SB-2을 단일 또는 혼합하여 가축의 in vivo 급여 실험을 통해 가축의 생산성 향상과 항생제 대체 효과를 가지는 생균제의 개발을 목적으로 수행되었다.
토양에서 분리한 균은 내생포자를 형성하는 그람 양성 세균이며 형태는 간균이었다. 생리 생화학적 특성과 16S rDNA 염기서열 분석 결과 등을 바탕으로 Bacillus subtilis로 동정하였고, Bacillus subtilis SB-1로 명명하였다. 중국에서 분양 받은 균은 그람 양성 세균이며 포자를 형성하고 그 형태는 간균이다. 생리 생화학적 특성과 16S rDNA 분석 결과 Clostridium butyricum으로 동정 되었고, Clostridium butyricum SB-2로 명명하였다. 이들 균들은 내산성, 내담즙성, 내열성, 내염성, 타정압력 저항성, 항생제 감수성을 실험한 결과 이들은 비교적 안정한 균들이었다. B. subtilis SB-1은 가축의 다내재성 병원성 세균인 Staphylococcus aureus에 대해 항균력을 보였다. Jar-fermenter 배양에서 B. subtilis SB-1의 최대 생균수는 5.0×108 cfu/㎖, 포자는 9.0×107 cfu/㎖ 이었고, pH는 배양 8시간째 최저인 4.5였으나 점차 회복해서 배양 종료 시점에는 8이었다. C. butyricum SB-2은 최대 생균수는 2.0×108 cfu/㎖, 포자는 4.1×107 cfu/㎖ 였고, pH는 배양 시작 시점부터 점차 떨어져 배양 종료 시점에는 4.6이었다. B. subtilis SB-1 은 고양배양을 통해 생균수(1.0×109 cfu/g)와 포자수(8.8×108 cfu/g)의 증가를 확인하였고, pH의 저하는 발생하지 않았다. 고체배양 시 B. subtilis SB-1의 α-amylase의 활력은 배양 24시간에 12 unit으로 최대였고, β-amylase은 배양 12시간에 7 unit으로 최대였다. 중성 protease는 배양 72시간에 90 unit으로 최대 활력을, 산성 protease는 배양 48시간에 80 unit으로 최대 활력을 나타냈다. B. subtilis SB-1을 접종하여 고체배양 한 결과, 아미노산 glutamic acid가 발효 전보다 유의적으로 높았다.
비육돈 사양 시험 결과, B. subtilis SB-1와 C. butyricum SB-2 혼합 급여구에서 대조구에 비해 육색의 황색도가 유의적으로 높았고, 분내 암모니아 가스 농도도 대조구에 비해 낮았다. 자돈에게 C. butyricum SB-2의 사료 내 첨가 급여는 일당 증체량(ADG)와 일당 사료섭취량(ADF)을 증가시켰고, 사료요구율(FCR)은 감소하였다. 육계 사양 시험 결과, B. subtilis SB-1와 C. butyricum SB-2 혼합 급여구에서 분내 암모니아 가스 농도가 유의적으로 낮았고, 생산성 개선의 효과가 있었다. 산란계 사양 시험 결과 난의 albumin 함량이 처리구(61.4%)에서 유의적으로 높았고, 대란의 비율이 증가했다.
이상의 결과로부터 B. subtilis SB-1와 C. butyricum SB-2은 비병원성으로 확인 되었으며, 가축에게 급여한 결과, 암모니아 가스의 감소와 생산성 개선의 효과를 확인하였다. 따라서 이들은 생균제 균주로서 사용가치가 있을 것으로 판단된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The aim of this study was to develop the probiotics having substitution effect of antibiotics and improving productivity though feeding experiment in vivo in livestock, isolated from soil Bacillus spp. having antimicrobial activity, optimization of solid state fermentation(SSF) system for developing a cost-effective fermentation medium and large liquid culture system of Clostridium butyricum.
A gram-positive, endospore-forming, rod-shaped, bacterium was isolated from soil. Based on biological and physiological tests and the 16S rDNA sequence, strain was identified as Bacillus subtilis and named as Bacillus subtilis SB-1. A gram-positive, endospore-forming, rod-shaped, bacterium was taken from china. Based on biological and physiological tests and the 16S rDNA sequence, strain was identified as Clostridium butyricum and named as Clostridium butyricum SB-2.
B. subtilis SB-1 and C. butyricum SB-2 exhibited acid/bile salt/salt tolerance, heat /compressional pressure stability and antibiotic resistance. The B. subtilis SB-1 was inhibitory against the livestock bacterial pathogens Staphylococcus aureus. The maximum viable cell number and the spore number of B. subtilis SB-1 reached up to 5.0×108 cfu/ml and 9.0×107 cfu/ml under controlled Jar-fermenter, respectively. The lowest of pH was 4.5 at 8 hr, but 8 of pH was recorded at end point of culture. The maximum viable cell number and the spore number of C. butyricum SB-2 reached up to 2.0×108 cfu/ml, and 4.1×107 cfu/ml under controlled Jar-fermenter, respectively. A slight decrease in pH was observed, and 4.6 of pH was recorded at end point of culture. A marked increase in viable cell number(1.0×109 cfu/ml) and the spore number(8.8×108 cfu/ml) of B. subtilis SB-1 was achieved by optimization of solid state fermentation(SSF). A pH did not decrease during cultivation. On SSF, α-amylase activity was increased up to 12 unit at 24 hr and β-amylase was increased up to 7 unit at 12 hr of cultivation. On SSF, neutral protease activity was increased up to 90 unit at 72 hr and acid protease activity was increased up to 80 unit at 48 hr of cultivation. The activity of glutamic acid was higher at 72 hr of fermentation than before fermentation on SSF.
The yellowness of meat color in pig fed B. subtilis SB-1 were higher(P＜0.05) than that of the control group(non-fed), and amonia gas concentration in their feces was lower than that of the control group. The ADG(average daily gain) and ADFI(average daily feed intake) in piglets fed C. butyricum SB-2 were higher(P＜0.05) than that of the control group(non-fed) while F/G(feed : gain ratio) was lower than that of the control group. The amonia gas concentration in broiler's feces fed C. butyricum SB-2 and B. subtilis SB-1 was lower(P＜0.05) than that of the control group(non-fed). The albumen contents in laying hens fed C. butyricum SB-2 and B. subtilis SB-1 was higher(61.4%) than that of the control group(non-fed), and ratio of big eggs was increased, but that of middle eggs was decreased.
The results of this study, B. subtilis SB-1 and C. butyricum SB-2 are considered non-pathogen bacteria. On livestock fed those, amonia gas concentration in their feces was decreased, and they did increase livestock productivity. In conclusion, strains B. subtilis SB-1 and C. butyricum SB-2 have potential as probiotic strains for livestock.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 연구사 4
• 1. 생균제(probiotics)의 정의 4
• 2. 생균제의 효과 5
• 3. 생균제 균종 및 생균제로서의 조건 6
• 4. Bacillus subtilis와 Clostridium butyricum의 생균제적 특징 7
• 5. 생균제 제조 방법 고찰 9
• Ⅲ. 재료 및 방법 10
• 1. 균주 분리 10
• 1-1. Bacillus spp 분리 10
• 1-2. Bacillus spp의 항균력 12
• 1-3. C .butyricum 배양 12
• 2. 세균의 동정 12
• 2-1. 그람(포자) 염색 12
• 2-2. 용혈성(β-hemolysis) 13
• 2-3. 황화수소(hydrogen sulfide) 13
• 2-4. 인돌(indole) 13
• 2-5. Catalase 활성 13
• 2-6. 형태학적 특성 13
• 2-7. 지방산 14
• 3. 균주의 분자생물학적 동정 15
• 3-1. 16S rDNA 염기서열 분석 15
• 3-2. 계통학적 분석 15
• 4. B. subtilis SB-1 항균력 측정 16
• 5. 타정 압력 저항성 16
• 6. 열처리에 의한 안전성 18
• 7. 인공 위액에 대한 저항성 18
• 8. 인공 담즙산에 대한 저항성 18
• 9. NaCl(Sodium chloride) 안정성 19
• 10. 항생제(antibiotics) 감수성 19
• 11. 성장률 및 배양액의 pH 변화 19
• 12. 가스(Gas) 및 휘발성지방산(volatile fatty acids, VFA) 분석 20
• 13. 생균제의 제조 20
• 13-1. B. subtilis SB-1의 고체발효 21
• 13-2. C. butyricum SB-2의 액상 발효 23
• 13-3. 고체발효물 Protease 활성 26
• 13-4. 고체발효물 amylase 활성 26
• 13-5. 고체발효물 아미노산(amino acids) 분석 27
• 13-6. 생균제 생산 27
• 14. 가축 사양 시험 28
• 14-1. 비육돈 사양 28
• 14-1-1. 시험동물 및 시험설계 28
• 14-1-2. 시험관리 28
• 14-1-3. 조사항목 30
• 14-1-3-1. 생산성 30
• 14-1-3-2. 혈액 30
• 14-1-3-3. 육질 30
• 14-1-3-4. 분뇨 31
• 14-1-3-5. 통계처리 31
• 14-2. 이유자돈 사양 시험 32
• 14-2-1. 시험동물 및 시험 32
• 14-2-2. 생산성 32
• 14-2-3. 통계처리 32
• 14-3. 산란계 사양 시험 33
• 14-3-1. 시험동물 및 시험 33
• 14-3-2. 사양관리 33
• 14-3-3. 난질 33
• 14-3-4. 통계처리 34
• 14-4. 육계 시양 34
• 14-4-1. 시험동물 및 시험설계 34
• 14-4-2. 사양 34
• 14-4-3. 암모니아 가스 35
• 14-4-4. 통계처리 35
• Ⅳ. 결과 37
• 1. 세균의 동정 35
• 2. B. subtilis SB-1의 균체 지방산 분석 41
• 3. C. butyricum SB-2의 균체 지방산 분석 42
• 4. B. subtilis SB-1의 phylogenetic tree 43
• 5. C. butyricum SB-2의 phylogenetic tree 45
• 6. B. subtilis SB-1의 16s rDNA 염기서열 47
• 7. C. butyricum SB-2의16s rDNA 염기서열 49
• 8. B. subtilis SB-1의 인공 위산에 대한 저항성 53
• 9. C. butyricum SB-2의 인공 위산에 대한 저항성 54
• 10. B. subtilis SB-1의 담즙산에 대한 저항성 55
• 11. C. butyricum SB-2의 담즙산에 대한 저항성 56
• 12. B. subtilis SB-1의 내염성 57
• 13. C. butyricum SB-2의 내염성 58
• 14. B. subtilis SB-1의 항생제 내성 59
• 15. C. butyricum SB-2의 항생제 내성 61
• 16. B. subtilis SB-1의 타정 압력에 대한 저항성 63
• 17. C. butyricum SB-2의 타정 압력에 대한 저항성 64
• 18. B. subtilis SB-1의 열 안전성 65
• 19. C. butyricum SB-2의 열 안전성 66
• 20. C. butyricum SB-2의 배지 조성과 배양 조건 67
• 21. B. subtilis SB-1의 Jar-fermenter 배양 67
• 22. C. butyricum SB-2의 Jar-fermenter 배양 69
• 23. 고체배양의 배지조성 및 배양 조건 72
• 24. 고체배양에 따른 amylase(α,β) 변화 75
• 25. 고체배양에 따른 protease(중성, 산성) 변화 76
• 26. 고체배양에 따른 아미노산 변화 77
• 27. 생균제 제조 79
• 28. 비육돈 사양실험 79
• 28-1. 생산성 79
• 28-2. 혈액성상 81
• 28-3. 육질 특성 83
• 28-4. 분내 유해가스 함량 85
• 29. 자돈 사양 시험 87
• 30. 산란계 사양실험 89
• 30-1. 사료 효율 및 난중 89
• 30-2. 난조성 90
• 30-3. 난질 92
• 31. 육계 사양실험 94
• 31-1. 분내 암모니아 가스 발생량 94
• Ⅴ. 고찰 95
• 참고문헌 101
• Abstract 113