Development of a novel murine epigenetic clock for aging : biological insights and biomarker potential

국문 초록 (Abstract)

노화는 유전체 전반의 DNA 메틸화 양상이 점진적이고 광범위하게 재구조화되는 과정이며, 이러한 변화를 이용해 생물학적 노화를 정량적으로 추적하는 후성유전 시계를 구축할 수 있다. 그러나 마우스에서 개발된 DNA 메틸화 기반 시계는 대부분 내부 장기나 희생을 필요로 하는 조직을 기반으로 하고 있어, 개별 동물을 반복적으로 추적하는 종단 연구에 활용하기에는 한계가 있다. 혈액은 사람 연구에서 후성유전 시계 구축에 가장 널리 사용되는 시료인 반면, 마우스 실험에서 꼬리 조직은 상대적으로 침습도가 낮고 반복 채취가 가능함에도 불구하고 DNA 메틸화 노화 바이오마커의 기질로서는 충분히 탐색되지 않았다. 본 연구에서는 마우스 혈액과 꼬리에서 나타나는 연령 관련 DNA 메틸화 패턴을 체계적으로 비교하고, 그 생물학적 의미를 해석하며, 각 조직이 조직 특이적 연령 예측 모형을 구축하는 데 얼마나 적합한지를 평가하고자 하였다. 수컷 C57BL/6N Per2::Luc 마우스에서 성체 초기부터 노령기에 이르는 연령대를 포괄하도록 혈액과 꼬리 시료를 짝지어 수집하였다. Infinium Mouse Methylation BeadChip을 이용해 전장 수준의 DNA 메틸화 프로파일을 생성하고, SeSAMe 파이프라인과 표준 품질 관리를 통해 고품질 β값을 확보하였다. 주성분 분석 결과, 혈액과 꼬리는 뚜렷하게 분리되었으며, 각 조직 내에서도 연령이 순서대로 배열되는 구조가 관찰되어, 조직 정체성 위에 강한 연령 관련 변이가 중첩되어 있음을 시사하였다. 단일 프로브 수준에서 선형회귀(β ~ 연령, FDR < 0.05)를 적용한 결과, 혈액에서는 78,111개의 연령 관련 CpG, 꼬리에서는 38,348개의 연령 관련 CpG가 확인되었고, 궤적은 서로 달랐다. 혈액은 전반적인 저메틸화 패턴과 더불어 중년기에서 노년기로 넘어가는 시점에 급격한 변화가 나타난 반면, 꼬리는 고메틸화와 저메틸화가 거의 균형을 이루면서 젊은 시기에서 중년기로 이행하는 구간에서 더 이른 시점에 완만한 변화가 나타나, 조직별로 구분되는 노화 궤적을 보여주었다. 영역 기반의 차등 메틸화 영역(DMR) 분석을 통해 이러한 양상을 보다 명확히 하였다. 인접 CpG를 하나의 구간으로 집계한 뒤 FDR < 0.05 기준을 적용한 결과, 혈액에서 31,322개, 꼬리에서 21,883개의 연령 관련 DMR이 확인되었다. 조직별로 살펴보면, 두 조직 모두에서 연령 관련 DMR은 전사 시작점 인근을 포함한 프로모터 영역에 강하게 집중되어 있어, 노화가 특히 근위 조절 요소를 선호적으로 변화시킨다는 점을 시사하였다. CpG 문맥은 조직에 따라 달랐는데, 혈액에서는 고메틸화 DMR이 CpG island에 상대적으로 풍부하고 저메틸화 DMR은 CpG가 드문 Open Sea 쪽으로 치우친 반면, 꼬리에서는 메틸화 방향과 관계없이 대부분의 DMR이 Open Sea에 위치하였다. 메틸화 변화 방향을 고려하여 혈액과 꼬리의 DMR을 겹침 분석한 결과, 총 6,229개의 공통 연령 관련 DMR이 확인되었으며, 이들은 CpG island에서의 고메틸화와 Open Sea에서의 저메틸화가 동시에 나타나는 전형적인 노화 패턴을 재현하였다. 이 공통 DMR에 연결된 유전자는 발달, 신경, 면역, 신호전달 관련 경로에 유의하게 풍부하게 분포하여, 핵심 조절 네트워크를 표적으로 하는 보존된 조직 간 후성유전적 노화 모듈을 형성함을 시사한다. 이러한 시그니처를 바탕으로 조직 특이적 elastic-net 회귀 모형을 구축하여 DNA 메틸화 β값으로부터 연령을 예측하였다. 학습 코호트에서 혈액 기반 시계(α = 0.8, 72 CpG)는 평균절대오차(MAE) 2.30주, 결정계수(R²) 0.99를 보였고, 꼬리 기반 시계(α = 0.5, 192 CpG)는 MAE 2.75주, R² 0.98의 성능을 나타냈다. 혈액 시계는 독립된 암컷 혈액 외부 검증 데이터에서 MAE 13.48주, R² 0.76으로 일반화 가능성을 보였다. 특히 두 시계에 포함된 모든 CpG는 단변량 분석에서 독립적으로 연령 관련 CpG로 동정된 사이트와 중복되어, 선택된 CpG가 단순한 통계적 산물이 아니라 생물학적으로 의미 있는 연령 신호를 반영함을 지지한다. 종합하면, 혈액과 꼬리 메틸롬은 서로 겹치지만 구별되는 DNA 메틸화 노화 신호를 지니며, 혈액 및 꼬리 기반 후성유전 시계는 마우스 수준의 노화를 상호 보완적으로 포착하는 도구가 될 수 있음을 보여준다. 다만, 본 연구는 표본 수가 제한적이고, 수컷만을 대상으로 한 횡단면 설계이며, 수명 연장이나 단축을 유도하는 중재 실험이 포함되지 않아 성별 차이와 인과적 효과에 대한 해석에는 한계가 있다. 향후에는 더 큰 규모의 성별 균형 코호트와 종단 추적, 그리고 식이, 약물, 유전적 조작과 같은 수명 조절 중재를 포함한 연구를 통해 이러한 조직 특이적 시계의 견고성과 민감도를 검증하고, 마우스 노화 연구에서 혈액과 꼬리 DNA 메틸화 지표를 최적 활용하는 전략을 정립할 필요가 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Aging is accompanied by progressive and widespread remodeling of DNA methylation (DNAm), and these changes can be leveraged to construct epigenetic clocks that quantitatively track biological aging. In mice, however, most DNAm clocks have been developed from internal organs or terminal tissues, which limits their utility for longitudinal studies in individual animals. Blood is routinely sampled and widely used in human epigenetic clock research, whereas tail biopsies offer a minimally invasive, repeatedly accessible tissue in mouse experiments but remain underexplored as a substrate for DNAm aging biomarkers. This study systematically compared age-associated DNAm patterns in blood and tail, interpreted their biological implications, and evaluated their suitability for constructing tissue-specific DNAm age predictors. Matched blood and tail samples were collected from male C57BL/6N Per2::Luc mice spanning early adult to old age (7 to 103 weeks old). Genome-wide DNAm profiles were generated using the Infinium Mouse Methylation BeadChip and preprocessed with SeSAMe to obtain high-quality β-values after standard quality control. Principal component analysis revealed strong separation between blood and tail and age-ordered structure within each tissue, indicating robust age-related variation superimposed on tissue identity. Probe-level linear regression models (β ~ Age, FDR < 0.05) identified 78,111 age-associated CpGs in blood and 38,348 in tail, but their trajectories differed. Blood displayed a predominantly hypomethylating pattern and a late-abrupt shift between mid-life and old age, whereas tail showed a nearly balanced mixture of hyper- and hypomethylation and earlier, smoother transitions between young and mid-life, indicating distinct tissue-specific aging trajectories. Region-based differentially methylated region (DMR) analysis further clarified these patterns. Aggregating CpGs into segments and applying FDR < 0.05 yielded 31,322 age-related DMRs in blood and 21,883 DMRs in tail. At the tissue level, age-related DMRs in both blood and tail were strongly enriched at promoters, particularly in transcription start site–proximal regions, indicating that aging preferentially affects proximal regulatory elements. CpG-context patterns were tissue specific: in blood, hypermethylated DMRs were relatively enriched in CpG islands whereas hypomethylated DMRs were skewed toward CpG-poor Open Sea, while tail DMRs were predominantly located in Open Sea irrespective of methylation direction. Direction-aware overlap between blood and tail DMRs identified 6,229 shared age-related regions. These shared DMRs recapitulated the canonical pattern of CpG island hypermethylation with Open Sea hypomethylation and were linked to genes enriched for developmental, neuronal, immune, and signaling pathways, consistent with a conserved cross-tissue epigenetic aging module that targets core regulatory networks. Building on these signatures, tissue-specific elastic-net models were trained to predict chronological age from DNAm β-values. In the training cohort, the blood clock (α = 0.8, 72 CpGs) achieved a mean absolute error (MAE) of 2.30 weeks with R² = 0.99, and the tail clock (α = 0.5, 192 CpGs) achieved an MAE of 2.75 weeks with R² = 0.98. The blood-based clock generalized to an independent female blood dataset with an MAE of 13.48 weeks and R² = 0.76. Importantly, all CpGs selected by the clocks overlapped CpGs independently identified as age-associated in univariate tests, supporting the biological relevance of the chosen features rather than purely statistical artifacts. Taken together, these findings indicate that blood and tail methylomes carry overlapping but distinct DNAm aging signals and that blood- and tail-based epigenetic clocks provide complementary views on organismal aging in mice. However, the modest sample size, male-only and cross-sectional design, and absence of intervention data limit inferences about sex differences and causal effects. Future work with larger, sex-balanced, longitudinal cohorts and lifespan-modifying dietary, pharmacologic, or genetic interventions will be needed to test the robustness and responsiveness of these tissue-specific clocks and to optimize the use of blood and tail DNAm measures in mouse aging research.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• A. Background 1
• 1. Aging and its significance 1
• 2. Hallmarks of aging 3
• 3. Epigenetics and aging 4
• 4. Epigenetic clocks 8
• B. Objectives and hypothesis 12
• Ⅱ. Methods and materials 13
• A. Sample collection and in vivo bioluminescence measurement 15
• B. DNA isolation 16
• C. Measurement of DNA methylation profiling 16
• D. Preprocessing and quality control of methylation profiles 17
• E. Screening of age-related CpGs 18
• F. Analysis of k-means clustering and inter-age distances 18
• G. Identification of differentially methylated regions 19
• H. Functional annotation of CpG context and gene features 20
• I. Gene-set and pathway enrichment analysis 20
• J. Model generation: tissue-specific epigenetic clocks 21
• Ⅲ. Results 24
• A. Tissue-specific, age-related DNA methylation patterns 26
• B. Identification of tissue-specific DMRs 33
• C. Shared age-related DMRs between blood and tail. 39
• D. Functional enrichment analysis of shared DMRs 45
• E. Development of tissue-specific epigenetic clocks 55
• Ⅳ. Discussion. 59
• Ⅴ. Conclusion. 69
• Bibliography 70
• Appendix 77